血紅蛋白氧載體聯合依達拉奉局部預灌注對急性腦梗死模型大鼠神經元的保護作用及機制*

周正龍, 胡俞成, 韓潤敏, 彭瀚, 楊華, 向欣*

(1.貴州醫科大學附屬醫院 神經外科, 貴州 貴陽 550004; 2.濟源市中醫院 神經外科, 河南 濟源 459000)

急性腦梗死(acute cerebral infarction, ACI)是較為常見的一種急性腦血管疾病,具有較高的臨床病發率及致殘致死率［1-2］。ACI起病急、治療時間窗短,關鍵在于盡早開通閉塞血管以使缺血腦區獲得有效灌注［3-5］。血紅蛋白氧載體(hemoglobin oxygen carrier,HBOC)是運輸和傳遞氧分子的小分子物質,具有恢復缺血組織供氧的能力,為缺血組織供應、轉運氧橋,以增加缺血腦組織的氧供,對于缺血性腦血管疾病預后的改善具有顯著意義［6-8］。依達拉奉(edaravone,EDA)是一種常用于ACI的自由基清除劑,其分子質量低、容易穿透血腦屏障,具有消除神經細胞水腫、促進炎癥吸收、減輕炎性反應等神經保護作用的能力［9-11］。有研究發現,聯合用藥能更好地應對ACI腦缺血后的級聯反應,是ACI治療的研究熱點［12-14］。推測在HBOC與EDA聯合治療ACI的過程中,可能會表現出較單一藥物治療方案更明顯的協同保護作用,其涉及的保護機制也可能會更加多元化。因此,本研究結合HBOC與EDA的網絡藥理學和生物學驗證,探討二者聯合治療對ACI的神經保護作用及可能機制,為ACI灌注治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 清潔級雄性成年SD大鼠120只,8～12周齡,體質量250～300 g,由貴州醫科大學動物實驗中心提供［SYXK(黔)2018-0001］,研究獲得貴州醫科大學倫理委員會批準(1600286)。實驗過程中大鼠自由進食進水,實驗室溫度21～23 ℃,濕度40%～60%。

1.1.2主要儀器與試劑 微量注射泵購自宿州百意醫療器械有限公司,生物組織自動組織脫水機購自武漢俊杰電子有限公司,流式細胞儀購自美國BD Bioscience公司,SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司,一步法快速Western blot試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (Caspase-3)、缺氧誘導因子-1α (HIF-1α)、白細胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司;HBOC-201購自北京潤方生物醫藥研究有限公司,EDA注射液購自南京先聲東元制藥有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1網絡藥理分析數據庫及軟件 PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/),Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/),OMIM數據庫(https://omim.org/),Genecards數據庫(https://www.genecards.org/),David數據庫(https://david.ncifcrf.gov/),STRING數據庫(https://string-db.org/),Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/ venny/),Uniprot數據庫(https:// www.uniprot.org/),Cytoscape3.9.1軟件,R4.2.1軟件等。

1.2.2藥物及疾病靶點篩選 在NCBI的PubChem數據庫中檢索HBOC及EDA的基本信息,使用PharmMapper數據庫和Swiss Target Prediction數據庫獲取靶點,經uniprot數據庫對靶點名稱矯正統一、去除重復靶點,分別獲得HBOC及EDA對應靶點;使用OMIM、GeneCards數據庫以“acute cerebral infarction”為關鍵詞進行檢索,去除重復靶點后獲得ACI對應靶點。

1.2.3共同靶點的篩選及“藥物-靶點-疾病”網絡的構建 在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺上輸入藥物靶點與疾病靶點,將獲得的HBOC、EDA和ACI的靶點相交,繪制維恩圖提取共同靶點;將共同靶點輸入Cytoscape 3.9.1軟件中,繪制出“藥物-靶點-疾病”網絡圖。

1.2.4基因通路和功能分析 將預測的共同靶點導入DAVID數據庫,采用GO富集分析及KEGG通路富集分析HBOC聯合EDA治療ACI中的生物過程及信號通路,設置P<0.05為篩選條件,選擇排名靠前的生物過程及信號通路,使用R語言對富集結果進行可視化,繪制條形圖與氣泡圖。

1.2.5“藥物-靶點-疾病-關鍵通路”網絡的構建與核心靶點的獲得 選擇P值最小的前4個通路的氣泡圖,在Cytoscape 3.9.1軟件中構建“藥物-靶點-疾病-關鍵通路”的網絡圖并進行可視化分析;將關鍵通路的對應靶點導入STRING數據庫,將物種設置為“Homo sapiens”,檢索蛋白質相互作用關系,設置最低的相互作用閾值(中等置信度=0.4),其他參數保持在默認值;結果被保存為TSV文件后,導入到Cytoscape 3.9.1軟件中,將節點的大小和顏色與程度相關,并將邊緣的厚度與聯合評分相關,繪制出蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction networks,PPI),篩選核心靶點。

1.2.6實驗動物模型的制備及分組 將大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、HBOC治療組、EDA治療組、HBOC聯合EDA治療組(聯合治療組),每組24只。按參考文獻［15］方法建立大鼠大腦中動脈梗死(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,建模3 h后,采用微量注射泵將生理鹽水(6 mL/kg)、HBOC(6 mL/kg)、EDA注射液(1.5 mL/kg)、或HBOC(6 mL/kg)和EDA注射液(1.5 mL/kg)聯合經微導管分別持續泵入模型組、HBOC治療組、EDA治療組、聯合治療組大鼠頸外動脈遠端,除假手術組外其余各組大鼠繼續梗死1 h后取出線栓,恢復血流進行再灌注;而假手術組僅分離大鼠動脈,不插入線栓,即僅給予麻醉及頸正中切口,然后縫合。

1.2.7神經功能缺損評分 術后24 h,運用Zea Longa法神經功能缺損評分標準對各組大鼠進行神經功能缺損評分:神經缺損癥狀不明顯、活動正常為0分,提尾時病灶對側前肢體不完全伸直為1分,向患側對側轉圈為2分,向患側對側傾倒為3分,活動障礙、意識喪失為4分。

1.2.8腦缺血梗死灶及腦水腫體積的測定 完成神經功能評分后,將大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后斷頭處死,立即取出腦組織放入-20 ℃冰箱,冷凍20 min后放置于腦槽內,從額極開始向后切下厚度約2 mm的5張連續冠狀腦組織切片,并迅速置于10 mL含1% 2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中, 37 ℃避光培養30 min,每5 min晃動、翻面1次(保證腦片著色均勻)。染色結束后,將切片轉移到4%多聚甲醛溶液中固定24 h,取出固定好的腦切片拍照留存,應用Image J軟件(Image J 1.37v)圖像分析軟件進行數據分析,按參考文獻［16］計算腦梗死灶體積及腦水腫體積。

1.2.9蘇木精-伊紅(HE)染色觀察腦組織神經元變化 每組隨機取6只大鼠,于術后24 h麻醉斷頭處死,迅速取出患側額葉腦皮質組織,用4%多聚甲醛固定標本2 h,蒸餾水浸泡4 h,脫水、浸蠟、包埋、切片等處理后進行HE染色。高倍鏡下(400×)觀察各切片相同部位的大腦皮質區神經元形態,每組隨機選擇皮質區的5個視野拍照。

1.2.10流式細胞術檢測腦組織細胞凋亡 參考文獻［17］,每組隨機取6只大鼠,于術后24 h麻醉斷頭處死,收集患側額葉腦皮質組織,用400 μL預冷PBS洗滌腦細胞2次,用30 μm孔徑的過濾器過濾,并調節細胞濃度為1×109CFU/L,以2 000 r/min離心10 min,棄上清液后加入1×膜聯蛋白V(Annexin V)結合液400 μL及膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)染色液5 μL,輕懸混勻于2～8 ℃避光條件下孵育15 min,再加入碘化丙啶(PI)染色液10 μL,輕懸混勻,2～8 ℃避光條件下孵育5 min,立即用流式細胞儀檢測。流式細胞儀激發波長為488 nm,Annexin V以FITC標記,配合PI同時染色檢測凋亡,使用525 nm的帶通濾片檢測FITC,使用610 nm的帶通濾片檢測PI,分別通過FITC和PI對數熒光散點圖分析凋亡細胞、活細胞和壞死細胞百分率。根據判讀標準,在雙變量流式細胞儀的散點圖上,左下象限顯示活細胞,左上象限顯示壞死細胞,右上象限為晚期凋亡細胞,右下象限為早期凋亡細胞。在每一散點圖的下方列出各象限的比例,可得到該散點圖中壞死細胞百分率、晚期凋亡細胞百分率、早期凋亡細胞百分率及活細胞百分率。

1.2.11Western blot驗證核心靶點基因的表達 每組隨機取6只大鼠,于術后24 h麻醉斷頭處死,迅速取出患側額葉腦皮質組織加入含有適量液氮的研缽里,研磨后加入組織裂解液,放入組織勻漿機中進行勻漿,使組織盡量碾碎,在冰上靜置15～30 min使之充分裂解。將勻漿液放入離心管中12 000 r/min離心30 min,上清轉移至新的預冷離心管中,處理蛋白隨后上樣。采用SDS-PAGE分離總蛋白,隨后用濕轉法轉移至PVDF膜上,將一抗(Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α、GAPDH)用抗體稀釋液按適當的比例進行稀釋,PVDF膜用一抗于4 ℃孵育過夜,然后用二抗室溫孵育2 h后顯影。將膠片進行掃描,采用凝膠成像系統分析蛋白條帶的灰度值,目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值等于目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 共同靶點的篩選及“藥物-靶點-疾病”網絡構建

通過文獻數據庫結合PharmMapper、Swiss Target Prediction及Uniprot數據庫,獲得HBOC對應靶點308個、EDA對應靶點90個、ACI對應靶點1 109個,在Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺上,繪制維恩圖,結果顯示HBOC、EDA和ACI共同靶點106個,見圖1。在Cytoscape 3.9.1軟件中輸入藥物與疾病的共同靶點,構建“HBOC/EDA-靶點-ACI”網絡圖,見圖2。

注：紫色為HBOC對應靶點,藍色為EDA對應靶點,綠色為ACI對應靶點,藥物與疾病的交集為共同靶點。

注：黃色為藥物HBOC及EDA、藍色為藥物與疾病的106個共同靶點、紅色為疾病ACI。

2.2 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將HBOC聯合EDA治療ACI的共同靶點導入DAVID數據庫進行GO富集分析及KEGG通路富集分析。GO富集分析顯示共同靶點與凋亡過程的調控、對缺氧的反應、藥物反應等生物過程相關,KEGG通路富集分析顯示共同靶點主要參與IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。見圖3。

注：A為共同靶點的GO富集分析結果中P值排名前10的途徑繪制的條形圖,BP為生物學過程、CC為細胞組分、MF為分子功能;B為共同靶點的KEGG通路富集分析結果中P值排名前20的通路繪制的氣泡圖。

2.3 “藥物-疾病-靶點-關鍵通路”網絡的構建及核心靶點的獲得

結果顯示,在前4個關鍵通路中有32個靶點被富集(圖4)。為了進一步探討在關鍵通路中可能存在的核心靶點,構建關鍵通路中富集的32個靶點PPI網絡圖結果顯示Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α等靶點的節點相對較大,顏色相對較暗,提示有較高的度值,表明它們可能是HBOC和EDA聯合治療ACI的關鍵靶點,可能在評價治療效果中發揮重要作用(圖5)。

注：淺紅色ACI,紫色代表4種關鍵通路,綠色表示參與通路的32個靶點,淺棕色代表藥物(EDA與HBOC);節點之間的邊緣代表它們之間的相互作用。

注：圓形節點代表靶點,節點之間的直線表示兩個連接蛋白之間的相互作用;圓圈越大,顏色越深,度值就越大;線越厚,蛋白質之間的結合就越近。

2.4 大鼠神經功能評分

術后24 h,模型組和各治療組大鼠的神經功能缺損評分均高于假手術組,差異有統計學意義(P<0.5); HBOC治療組、EDA治療組和聯合治療組的神經功能評分低于模型組,差異有統計學意義(P<0.05),聯合治療組低于HBOC治療組和EDA治療組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠術后24 h的神經功能評分比較

2.5 大鼠腦梗死灶體積與腦水腫體積

術后24 h,與假手術組比較,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯合治療組大鼠的腦梗死灶體積和腦水腫體積增加,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,HBOC治療組,EDA治療組和聯合治療組的腦梗死灶體積和腦水腫體積明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05)。其中,聯合治療組腦梗死體積和腦水腫體積明顯低于HBOC治療組和EDA治療組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠術后24 h腦梗死灶體積及腦水腫體積比較

2.6 大鼠腦組織神經元形態觀察

結果顯示,術后24 h,假手術組大鼠腦組織中可觀察到正常神經元細胞,神經元排列密集整齊、層次清晰、結構完整,神經元形態圓潤、輪廓清晰、胞內胞質均勻、細胞核正常居中;模型組大鼠腦組織中神經元細胞結構明顯異常,細胞排列相對紊亂,形態不規則,大量細胞皺縮,核染色質固縮、邊集、碎片化,大量凋亡小體形成;HBOC治療組、EDA治療組和聯合治療組大鼠腦組織中正常神經元細胞數量出現不同程度減少,胞體腫脹變形,排列疏松,形態不規則,核仁不同程度固縮、碎片化。HBOC治療組與EDA治療組大鼠腦組織中神經元細胞排列較模型組清楚,較聯合治療組紊亂。聯合治療組大鼠腦組織中神經元細胞排列規則,邊界清晰,碎片化核仁和凋亡小體顯著減少。見圖6。

圖6 各組大鼠術后24 h腦組織中神經元形態

2.7 大鼠腦組織細胞凋亡

術后24 h,與假手術組比較,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯合治療組大鼠腦組織出現大量細胞壞死、凋亡細胞數量增多、正常細胞數量減少,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯合治療組的凋亡細胞數量減少、正常細胞增多,差異有統計學意義(P<0.05);聯合治療組壞死細胞和凋亡細胞數量低于HBOC治療組與EDA治療組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7和表3。

表3 各組大鼠術后24 h腦組織的細胞凋亡率比較

圖7 各組大鼠術后24 h腦組織的流式細胞術檢測結果

2.8 關鍵靶點蛋白的表達

術后24 h,與假手術組比較,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯合治療組大鼠腦組織的Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α蛋白表達水平上調,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯合治療組的Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平下調,其中,聯合治療組的Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平低于HBOC治療組與EDA治療組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖8。

注：A為Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α蛋白的Western blot檢測結果,B為Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α蛋白的定量結果;(1)與假手術組相比,P<0.05;(2)與模型組相比,P<0.05;(3)與HBOC治療組相比,P<0.05;(4)與EDA治療組相比,P<0.05。

3 討論

ACI發生以后,缺血腦組織會發生一系列級聯反應,梗死局部間質水腫、腦血管受壓、微血栓聚集,進而使紅細胞無法到達病灶部位,組織缺血缺氧對半暗帶進一步損害,最終導致更大面積的病損及更嚴重的神經功能缺失［18］。針對治療缺血性損傷的多種方法,聯合治療比單一治療策略具有優勢［19-20］。本研究結合HBOC與EDA的網絡藥理學和生物學驗證,探討其聯合治療對ACI的神經保護作用及相關機制。

網絡藥理學是一個多學科的研究領域,通過建立數據庫、建立網絡、分析網絡和進行實驗驗證來解釋疾病的發展過程［21-22］。網絡藥理學利用組學整合了系統生物學,為從生物平衡的角度探索中藥或天然活性物質的作用機制和開發中藥活性成分提供了有力的工具。此外,還可以直觀地呈現藥物-靶點-疾病的網絡圖,可以預測治療過程中的作用靶點和信號通路,進而預測其潛在的作用機制,這是開發新藥的有效途徑之一［23-25］。本研究通過網絡藥理學預測HBOC聯合EDA治療ACI的106個共同靶點,并分析了這些靶點的GO富集分析和KEGG通路富集分析,預測在治療過程中可能發揮的作用,并檢測靶點的程度值。結果顯示這些靶點參與凋亡過程的調控、對缺氧的反應等生物過程,并可能通過IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等途徑在ACI治療中起神經保護作用。

為了進一步探討在關鍵通路中可能存在的核心靶點,本研究構建了通路中富集的32個靶點的PPI網絡,結果顯示Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α可作為HBOC和EDA聯合治療ACI的關鍵靶點。研究證實,腦組織缺血缺氧后會啟動細胞凋亡程序,細胞凋亡的過程是水解底物的級聯放大反應過程［26］。Caspase-3作為Caspase家族蛋白的凋亡執行因子,是細胞凋亡級聯反應的最終執行蛋白［27］。腦缺血損傷發生后,細胞內會生成大量氧自由基,隨著細胞膜被逐漸破壞,溶酶體、線粒體等細胞器均受到不同程度損傷,凋亡蛋白Caspase-3經不同途徑被激活,最終導致細胞凋亡。HIF-1是一種轉錄因子,它存在于人體和哺乳類動物的細胞內,對細胞的代謝調節以及介導機體適應低氧環境起關鍵性作用［28］。HIF-1α在細胞缺血缺氧時表達上調,位于下游的促凋亡基因表達受到調控后表達增加,進一步促進細胞凋亡,HIF-1α表達的上調與細胞凋亡呈正相關的關系［29］。缺血性腦損傷伴隨著明顯的炎性反應,炎性反應由炎癥細胞的積聚和炎癥介質的表達引起并加重,炎性反應的抑制可以保護缺血性腦損傷［30］。在炎性反應中,IL-6、TNF-α起著重要作用。IL-6是腦缺血炎性反應的關鍵介質,其介導的神經炎癥加重了腦損傷,在缺血和缺氧刺激下,IL-6在神經元和膠質細胞中表達明顯升高,而抑制IL-6表達可以減輕缺血缺氧造成的損傷［31］。TNF-α是腦梗死后的重要炎性因子,可直接損傷腦組織,同時能誘導局部組織產生炎性因子,引起炎癥級聯反應［32］。經生物信息學預測,在本研究中,Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α可作為HBOC和EDA聯合治療ACI的關鍵靶點。本研究結果也顯示,檢測Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α含量的變化可能作為HBOC和EDA聯合治療ACI的關鍵指標,可能在評價治療效果中發揮重要作用。

本研究的生物學實驗主要在行為學水平、細胞水平、分子水平等方面進行療效評估。神經功能評分是評價腦損傷病情預后的重要依據［8］。本研究采用改良的神經功能缺損評分標準評價HBOC聯合EDA對ACI大鼠神經功能的改善效果,結果顯示聯合用藥后大鼠神經功能評分顯著降低。此外,研究發現聯合治療在減輕腦梗死體積和水腫體積的作用上均較單獨治療有更好的效果。提示聯合治療方案對大鼠腦梗死后的神經功能缺損癥狀有明顯的改善作用,且其療效優于單獨用藥方案。另一方面,本研究通過HE染色觀察各組大鼠腦組織神經元變化,結果表明聯合用藥能有效改善腦缺血的神經元病變。

在本研究中,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯合治療組大鼠腦組織的Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達水平均較假手術組明顯升高,同時通過流式細胞術檢測大鼠腦組織細胞凋亡程度顯示模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯合治療組出現大量細胞壞死,細胞凋亡數量增多,正常細胞數量明顯減少,說明腦梗死后細胞凋亡程序被啟動,凋亡因子Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達水平上調。通過與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯合治療組的Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達水平均有不同程度的降低,流式細胞術顯示腦組織凋亡、壞死細胞比例減少、正常細胞增多,說明在腦梗后凋亡程序的啟動中,各治療組對細胞凋亡均表現出不同的抑制作用。其中,聯合治療組細胞壞死和細胞凋亡數量明顯低于HBOC治療組與EDA治療組,表明聯合治療對腦梗死后啟動的凋亡程序具有更明顯的抑制作用,通過下調凋亡因子Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達水平,從而發揮更明顯的神經保護作用。此外,本研究發現,IL-6、TNF-α等炎癥因子在腦梗死后的蛋白表達水平表現出明顯升高趨勢,提示腦梗死后炎性反應被激活。與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯合用藥治療組的IL-6、TNF-α蛋白表達水平均有不同程度的降低,說明各治療組對腦梗死后出現的炎性反應均有不同程度的抑制作用。其中,聯合治療組的IL-6、TNF-α 蛋白表達水平明顯低于HBOC治療組與EDA治療組,說明聯合用藥對腦梗死后的炎性反應的抑制作用更大,從而發揮更明顯的神經保護作用。

綜上,本研究通過網絡藥理學分析,預測HBOC與EDA聯合用藥的協同效應,并通過生物學實驗在行為學水平、細胞水平、分子水平等方面進行療效評估,初步證明HBOC和EDA聯合治療可以明顯改善大鼠神經功能缺損癥狀,減輕腦水腫和梗死體積,抑制細胞凋亡,且療效較單一用藥更為明顯,其聯合用藥的神經保護作用機制可能通過多靶點、多途徑方式減輕炎癥反應與細胞凋亡。本研究為今后臨床實驗的開展和ACI的治療提供了新的思路。