辣椒素對CIA大鼠關節滑膜組織抗炎作用及機制*

李雨, 王杰, 陳銘勰, 艾麗霞, 張耀文, 何子晗, 吳遵秋*, 李蓉*

(貴州醫科大學 基礎醫學院, 貴州 貴陽 550025)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種發病率較高的慢性自身免疫性疾病,基本病理表現為關節滑膜炎癥、滑膜組織過度增生及血管翳形成,并逐漸出現關節軟骨和骨破壞,最終導致關節畸形和功能喪失［1-3］。治療RA的藥物主要有非甾體抗炎藥物、糖皮質激素類藥物、生物制劑等,但存在不良反應較多或價格昂貴等缺點［4-6］,所以新型藥物的研發備受重視,辣椒素等中藥有效單體成分已成為近年來研究的新熱點［7］。辣椒素(capsaicin,CAP)是辣椒中最主要的生物活性成分［8-9］,具有抗炎、抗腫瘤及抗氧化等藥理作用［10］,可作為類風濕性關節炎的神經調節劑［11］,且有研究證明P38MAPK信號通路與類風濕性關節炎的炎癥細胞激活、滑膜異常增生等病理過程密切相關［12］,被認為是細胞信息傳遞的交匯點和共同通路,目前未見CAP通過P38MAPK信號通路治療RA炎癥的報道,因此本研究建立膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠模型,基于P38MAPK信號通路探究CAP對 CIA 模型大鼠的抗炎作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠48只,由貴州醫科大學動物中心提供［SYXF(黔)2018-0001］。

1.1.2主要試劑與儀器 辣椒素(CATO公司),不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's Adjuvant,IFA,美國Sigma),牛Ⅱ型膠原蛋白(美國Chondrex),大鼠IL-17 ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司),逆轉錄試劑盒(索萊寶科技有限公司),β-actin、p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13、Casepase-3抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG(華安生物科技公司);水平電泳槽(DYY-DI 31D,北京六一儀器廠),冷凍高速離心機(美國thermo公司),高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠),超凈工作臺(吳江市偉峰凈化設備有限公司),Quanity One凝膠成像分析系統(美國BIO-RAD公司),DYY-5型穩壓穩流電泳儀(北京六一儀器廠),酶標儀(美國 BioTek),實時熒光定量PCR儀(美國ABI)。

1.2 研究方法

1.2.1動物分組 48只雄性SD大鼠,隨機分成空白組(normal,Nor組)、模型組(model,Mod組)、雷公藤治療組(tripterygium wilfordii,GTW組)及CAP高(3 mg/kg)、中(2 mg/kg)、低劑量(1 mg/kg)組,每組8只。

1.2.2CIA大鼠模型的建立 將牛Ⅱ型膠原蛋白與IFA 按1∶1充分乳化,40只大鼠尾根部皮下注射0.2 mL上述乳劑進行初次免疫,1周后于大鼠足跖部皮下注射0.1 mL上述乳劑加強免疫［13-14］;Nor組大鼠采用等體積生理鹽水代替。加強免疫1周后,通過關節炎指數(arthritis index,AI)評分判定造模情況。

1.2.3給藥 造模2周后,CAP高、中、低劑量組分別給予3 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg的CAP溶液灌胃,GTW組給予40 mg/kg雷公藤溶液灌胃,Nor組及Mod組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃,每日1次,連續給藥3周［15］。

1.3 觀察指標

1.3.1大鼠足腫脹度及AI測定 于造模前1 d至灌胃給藥3周后,每周測量1次大鼠足容積,測量方法為:使用導管連接同等大小兩個注射器,右側注射器使用馬克筆標注并加水至標注處,以大鼠后足踝關節轉折部位處為界限并標記,將大鼠足爪浸入至左側注射器,抽取右側注射器上升的水至標注處,讀取抽取的水體積數即為大鼠的后側足容積［16］;并于灌胃給藥前1 d至灌胃給藥3周后,每周進行1次大鼠右后足AI評分,總分為4分,AI評分標準見表1［17］。

表1 AI評分標準

1.3.2大鼠滑膜組織學特征 灌胃給藥3周后,將各組大鼠的膝關節處滑膜組織取出,使用10%中性甲醛固定,15%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)脫鈣,梯度乙醇及二甲苯脫水透明,常規石蠟包埋切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察滑膜組織學特征。

1.3.3大鼠血清IL-17含量 灌胃給藥3周后,將大鼠心臟取出的全血室溫靜置20 min,3 000 r/min離心15min后取血清,按照測試試劑盒的說明書,采用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定大鼠血清樣品的IL-17含量,在450 nm波長下采用酶標儀測定其吸光度值,通過繪制標準曲線計算各組樣本濃度。

1.3.4大鼠滑膜組織中MKK3、P38MAPK、MMP-13和Caspase-3 mRNA表達 灌胃給藥3周后,取大鼠滑膜組織加氯仿、振蕩、靜置,離心取上清后加異丙醇、靜置,離心棄上清后加75%乙醇、洗滌沉淀、棄上清,晾干、加入DEPC 水溶解后得到RNA樣品;取RNA樣品水溶液1 μL于超微量紫外分光光度計上測A 260/A 280值,測定后配制逆轉錄反應體系將RNA逆轉錄為cDNA,采用實時熒光定量PCR(quantitative realtime PCR,qPCR)檢測滑膜組織中MKK3、P38MAPK、MMP-13和Caspase-3 mRNA表達。qPCR條件為:預變性95 ℃ 30 s;循環反應,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,循環40次;溶解曲線95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。用2-ΔΔCt計算法處理數據。引物序列見表2。

表2 RT-PCR引物序列

1.3.5大鼠滑膜組織中p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13和Caspase-3蛋白表達 灌胃給藥3周后,取出大鼠滑膜組織,加入放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、苯甲基碘酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑進行研磨,提取出蛋白質,采用BCA法測量提取的蛋白質濃度后,制膠、上樣、電泳、轉膜,用5%脫脂奶封閉2 h,分別加入一抗β-actin抗體、p-MKK3抗體、p-P38MAPK抗體、MMP-13抗體、Caspase-3抗體(1∶1 000),4 ℃過夜,洗膜,二抗(1∶10 000)孵育2 h,洗膜,曝光顯影,使用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠足腫脹度

與Nor組相比,Mod組大鼠足腫度增大(P<0.001)。與Mod組相比,灌胃3周后GTW組大鼠足腫度明顯減小(P<0.001),CAP高劑量組、中劑量組足腫度減小(P<0.01),CAP低劑量組足腫度有所減小(P<0.05);CAP 高劑量組與GTW組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 大鼠足腫度

2.2 大鼠右后足AI評分

與Nor組相比,Mod組大鼠AI評分顯著升高(P<0.001)。與Mod組相比,灌胃3周后各給藥組大鼠AI評分均降低,且CAP 高劑量組、GTW 組明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05)。見表4。

表4 大鼠右后足AI評分

2.3 大鼠滑膜組織學特征

Nor組大鼠未見成簇的滑膜細胞、炎性細胞浸潤及血管翳形成;與Nor組相比,Mod組大鼠滑膜組織有明顯的炎性細胞浸潤、大量成纖維細胞聚集和血管增生,部分區域軟骨陷窩基本消失。與Mod組相比,GTW組大鼠滑膜組織有少量炎性細胞浸潤、成纖維細胞聚集及滑膜組織輕度充血;CAP 低劑量組炎性細胞浸潤有所改善,軟骨組織中度增生,部分軟骨細胞腫脹壞死;CAP 中劑量組滑膜襯里下層大量纖維組織增生,且出現由軟骨破壞導致的關節翳形成,疑似個體差異;CAP 高劑量組關節腔內滑膜組織充血明顯減輕,未見明顯炎性細胞浸潤,也未見成纖維細胞成簇及分布密度改變。見圖1。

注：A為CAP高劑量組;B為CAP中劑量組;C為CAP低劑量組;D為Mod組;E為GTW組,F為Nor組。

2.4 大鼠血清IL-17含量

與Nor組相比,Mod組大鼠血清中IL-17含量明顯升高(P<0.01)。與Mod組相比,CAP高劑量組和GTW組血清中IL-17含量顯著降低(P<0.01)、CAP 中劑量組血清中IL-17含量降低(P<0.05);而CAP低劑量組與Mod組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 大鼠血清IL-17含量

2.5 大鼠滑膜組織中MKK3、P38MAPK、MMP-13和Caspase-3 mRNA的表達

與Nor組相比,Mod組大鼠MKK3、P38MAPK、MMP-13 mRNA表達升高(P<0.01),Caspase-3 mRNA表達降低(P<0.01)。與Mod組相比,CAP高劑量組和GTW組MKK3、P38MAPK、MMP-13mRNA表達降低(P<0.05),Caspase-3 mRNA表達升高(P<0.01);CAP中、低劑量組MKK3、P38MAPK、MMP-13和Caspase-3mRNA表達,差異無統計學意義(P>0.05)。 見圖2。

注：(1)與Nor組比較,P<0.05;(2)與Mod組比較,P<0.05;(3)與GTW組比較,P<0.05。

2.6 大鼠滑膜組織中p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13和Caspase-3蛋白表達

與Nor組相比,Mod組大鼠p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13蛋白表達升高(P<0.01),Caspase-3蛋白表達降低(P<0.01)。與Mod組相比,CAP高劑量組和GTW組大鼠p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13蛋白表達降低(P<0.01),Caspase-3蛋白表達升高(P<0.01);CAP 中、低劑量組p-MKK3、p-P38MAPK、MMP-13和Caspase-3蛋白表達,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：(1)與Nor組比較,P<0.05;(2)與Mod組比較,P<0.05;(3)與GTW組比較,P<0.05。

3 討論

RA是一種以侵蝕性、對稱性多關節炎為主要臨床表現的慢性、全身性自身免疫性疾病,病理變化以關節滑膜炎癥為主［18-19］。本研究通過牛Ⅱ型膠原與IFA造模后,造模組與Nor組大鼠相比,造模組大鼠后踝關節出現明顯腫脹、畸形,AI評分明顯升高,提示造模成功。經藥物治療3周后,病理切片可看出Mod組大鼠大量炎性細胞浸潤、成纖維細胞聚集;而CAP 高劑量組和GTW組病理變化明顯減輕,僅見少量炎性細胞浸潤和成纖維細胞聚集,提示CAP在緩解RA炎癥方面有良好的作用。

已有研究證明RA可導致P38MAPK信號通路異常激活,而異常激活的P38MAPK信號通路又進一步加重RA的炎性反應［20-21］。P38是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中控制RA炎性反應最重要的成員;MKK3是P38MAPK活化所必須的上游因子,過量磷酸化的MKK3可加重RA滑膜炎癥;MMP-13是P38MAPK的重要下游因子,活化的P38MAPK可通過上調MMP-13的表達導致Ⅱ型膠原進行性降解、促進滑膜細胞增生［22-23］;此外,被激活的P38MAPK還可上調介導RA炎癥的促炎因子IL-17表達［24］,下調促進RA滑膜細胞凋亡的促凋亡因子Caspase-3表達［25］。綜上可知,可通過抑制P38MAPK信號通路的活化改善RA的炎性反應。

本研究通過檢測大鼠滑膜關節組織中MKK3、P38MAPK、MMP-13、Caspase-3 mRNA及相關蛋白表達量變化和血清中IL-17含量變化,探究CAP對RA的抗炎作用機制。ELISA實驗結果顯示,Mod組IL-17含量較Nor組升高,經CAP治療后,各組大鼠血清IL-17含量降低,且CAP 高劑量組與GTW組IL-17含量相近,提示CAP治療RA的作用可能與其抑制促炎因子IL-17表達有關。PCR和WB實驗結果顯示,與Nor組相比,Mod組MKK3、P38MAPK、MMP-13表達升高,Caspase-3表達降低;與Mod組相比,CAP 高劑量組和GTW組MKK3、P38MAPK、MMP-13表達降低,Caspase-3表達升高,CAP 中、低劑量組差異無統計學意義,提示CAP可能抑制了P38MAPK信號通路的活化,且CAP 高劑量組與GTW組療效相近。

綜上所述,MKK3/P38MAPK/MMP-13信號通路、RA與CAP三者密切相關。本研究結果表明,CAP對RA有良好的抗炎作用,揭示其可能機制為抑制MKK3/P38MAPK/MMP-13信號通路的活化,減少炎癥因子IL-17的釋放,解除對促凋亡因子Caspase-3的抑制,從而達到改善RA的炎癥浸潤及骨破壞的目的。基于此研究,CAP可能成為雷公藤的替代療法,但本研究結果僅僅是初步提示,后續實驗可探究CAP作用于RA的其他分子機制,有利于進一步開發CAP的藥用價值,同時也為臨床上CAP治療RA提供理論依據。