東北馬鹿微衛(wèi)星CM41S16和CM12S18遺傳標記的群體遺傳學參數(shù)分析*

劉爽, 王一凡, 黃春華,2,3, 劉德芳,3, 張書環(huán),3, 樓迪棟,2,3**

(1.貴州中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州中醫(yī)藥大學 法醫(yī)中藥毒理學特色重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 3.貴州中醫(yī)藥大學 司法鑒定所, 貴州 貴陽 550025)

藥食兩用鹿血、鹿茸是珍貴的中藥材,易被偽制,因此其生物鑒別是重要的鑒定手段之一［1-4］。東北馬鹿(Cervuselaphusxanthopygus)是馬鹿中養(yǎng)殖開發(fā)較多的亞種［5］,但東北馬鹿基因組序列信息至今未見報道,造成其遺傳標記信息缺失［6-7］,生物鑒別困難,2018—2020年Nóra.Bana和Hengxing Ba等人分別對歐洲馬鹿和中亞馬鹿的全基因進行測序［8-9］。利用生物信息學比對種間(歐洲馬鹿和中亞馬鹿)基因組DNA生物信息,可以篩選到亞種東北馬鹿有用的DNA遺傳標記,即微衛(wèi)星(Microsatellite)DNA,擬實現(xiàn)對基因組序列信息缺失的東北馬鹿的遺傳標記開發(fā)。微衛(wèi)星即短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat, STR),是一類由1～6個核苷酸為重復單位組成的重復序列,總長度多在100～300 bp,廣泛分布于真核生物和原核生物基因組中,是基因組中兩端較為保守和多態(tài)性較高的一段序列［10］,具有操作簡單、高靈敏度和結果重復性好等優(yōu)點,廣泛應用于物種保護、種群遺傳多樣性研究,尤其是法醫(yī)學個體識別和親權鑒定中;與此同時微衛(wèi)星也存在一些弊端,當微衛(wèi)星的序列未知時可在其近緣物種中相互借用［6］,由于不同物種間偶爾會表現(xiàn)出特異性,進而導致引物通用性差。為了更好的對微衛(wèi)星進行遺傳多樣性的研究,需要針對特定的物種進行遺傳標記的開發(fā)。本文基于生物信息分析,利用兩種同源馬鹿并具有多態(tài)性的微衛(wèi)星遺傳標記對我國東北馬鹿的血樣進行跨種研究,應用法醫(yī)物證學STR群體遺傳學策略應用標準［11-14］,擬開發(fā)有效的STR遺傳標記,解決我國東北馬鹿動物藥材的生物識別和真?zhèn)舞b別困難等問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1生物信息學分析 獲取Ba和Bana等［8-9］報道的歐洲馬鹿(NCBI編號10790)和中亞馬鹿(NCBI編號67319)的基因組信息,利用微衛(wèi)星識別工具(MIcroSAtellite identification tool,MISA)對兩種馬鹿進行生物信息分析,獲得STR遺傳標記信息,篩選可能有多態(tài)性的引物20個。

1.1.2馬鹿血樣 馬鹿血樣取自吉林省長春市孫氏鹿業(yè),采集鹿茸時收集新鮮血液,共計48份;每份5 mL,抗凝劑檸檬酸鹽葡萄糖溶液(anticoagulant citrate dextrose solution, ACD)抗凝,-20 ℃保存。

1.1.3主要設備及試劑 Biometra PCR 儀( Haffman公司,德國),電泳系統(tǒng)(北京君意);Taq 聚合酶(MBI公司,美國),聚丙烯酰胺(Acr)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)(江蘇沃爾森);引物序列合成(上海生工)。

1.2 實驗方法

1.2.1DNA提取 模板DNA采用常規(guī)5% Chelex-100提取法［15］進行提取,具體步驟如下:(1)取10 μL ACD抗凝全血加1 mL ddH2O混勻裂解紅細胞,12 000 r/min離心30 s,離心后棄上清;(2)重復步驟1(2～3次)直至溶液無血色;(3)加5% Chelex-100 500 μL,56 ℃水浴60 min;(4)劇烈振蕩10 s,100 ℃水浴8 min,使蛋白變性;(5)劇烈振蕩10 s,12 000 r/min 離心30 s,取上清備用。

1.2.2PCR擴增 在200 μL EP管中依次加入:DNA模板1.0 μL(15 mg/L),10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL,超純水14.0 μL,Taq酶4 U,10×buffer 2.0 μL,dNTP 0.5 μL。將其混勻并置于Biometra PCR 儀進行PCR反應;反應程序為98 ℃ 15 s,95 ℃ 5 s,62.5 ℃ 20 s,72 ℃ 5 s,共32個循環(huán),72 ℃ 15 s,4℃保存。

1.2.3擴增產物的檢測 采用聚丙烯酰胺凝膠(T6%C3%)電泳檢測,PCR產物上樣量為1.5 μL,50 bpDNA ladder的上樣量為1 μL,電泳緩沖液為0.5×TBE,PCR產物于10 V/cm的電場,電泳時間為2.5 h,電泳結束后于溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)染色15 min,采用北京君意凝膠成像分析系統(tǒng)(JY04S-3C)拍照并分析結果。

1.2.4群體遺傳學多態(tài)性調查及統(tǒng)計學分析 分析PCR的擴增條帶,篩選擴增效果良好并且PCR產物長度大小有差異、具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物在48個馬鹿血樣DNA樣本中進行多態(tài)性的調查;聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后,將PCR產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化測序,使用Chormas分析軟件對測序結果與原始設計序列進行分析驗證;并根據(jù)張?zhí)K云等［16］報道的相關計算公式,計算基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC)、個體識別率(discrimination power,DP)等多態(tài)性參數(shù)。

2 結果

2.1 生物信息學分析及PCR擴增情況

兩種馬鹿基因組信息比對,發(fā)現(xiàn)STR在兩種馬鹿中存在保守的側翼序列,并隨機挑取合成了20對微衛(wèi)星引物。將上述引物通過PCR-PAGE實驗,驗證得出有10對微衛(wèi)星引物有陽性擴增產物,引物序列信息見表1;在陽性擴增產物中重復單位為二堿基的比例占80%(8/10),三堿基和五堿基各占10%(1/10),擴增結果顯示CM41S16(三堿基重復)和CM12S18(五堿基重復)可能具有多態(tài)性,進一步進行群體多態(tài)性研究。見圖1。

注：M為50 bp DNA ladder,1～2為東北馬鹿2個無親緣關系的樣品。

表1 10對陽性擴增的微衛(wèi)星預測序列及引物序列信息

2.2 PCR產物測序結果

對CM41S16和CM12S18基因座進行多態(tài)性檢測,發(fā)現(xiàn)具有高度多態(tài)性,并且測序結果與預測序列一致。見圖2,表2。

圖2 CM41S16和CM12S18測序峰

表2 CM41S16和CM12S18等位基因測序結果

2.3 CM41S16和CM12S18 群體遺傳學參數(shù)調查

通過對群體遺傳學參數(shù)調查發(fā)現(xiàn),CM41S16基因座的等位基因為5個,PIC為0.6206,DP為0.8396;CM12S18基因座的等位基因為5個,PIC為0.7212, DP為0.9035,累積個體識別率為98.5%。2個基因座群體遺傳學多態(tài)性參數(shù)見表3～表5。

表5 2個STR基因座的群體遺傳學參數(shù)

3 討論

目前微衛(wèi)星分子標記在物種的種質資源鑒定、分子輔助育種及遺傳多樣性研究方面廣泛應用,但是大部分沒有從法醫(yī)學標準進行系統(tǒng)性研究,這也造成了物種的鑒定應用缺乏標準化認識。張?zhí)K云等［16］利用微衛(wèi)星分析新疆塔里木馬鹿的遺傳多樣性,遺傳學參數(shù)只計算等位基因數(shù)和雜合度等,缺少個體識別率等重要參數(shù);張沼等［13］在內蒙古賽罕烏拉自然保護區(qū)東北馬鹿種群遺傳多樣性與性別結構分析中只提到雜合度和多態(tài)信息含量這兩個參數(shù),沒有對基因型頻率、等位基因頻率和個體識別率等參數(shù)進行計算。關于群體遺傳學參數(shù)的計算缺少標準化,本研究始終以法醫(yī)學標準,采用微衛(wèi)星對鹿血生物檢材進行群體遺傳學研究,為鹿藥材的生物識別得到更好的應用提供依據(jù)。

人類微衛(wèi)星遺傳標記在真核生物基因組分布廣泛,因樣品微量、結果準確和操作簡單等優(yōu)點被廣泛應用［17-20］,成為個人識別和親權鑒定的有效生物工具［21-25］。東北馬鹿因其基因組信息缺失,本研究通過比對同源跨種歐洲馬鹿和中亞馬鹿基因組信息,篩選了10對有效的東北馬鹿微衛(wèi)星基因座引物,并獲取了2個微衛(wèi)星基因座的多態(tài)性信息,通過測序驗證微衛(wèi)星核心序列特征,結果顯示擴增穩(wěn)定性好,重復序列符合簡單重復結構核心序列特征。PCR擴增產物在聚丙烯酰胺凝膠電泳處理后,條帶清晰,分型結果穩(wěn)定,分型易數(shù)字標準化。CM41S16檢出5個等位基因(7～11),頻率最高的等位基因為8; CM12S18檢出5個等位基因(1～5),頻率最高的等位基因為5。CM41S16和CM12S18基因座等位基因頻率分布好,PIC值分別為0.620 6和0.721 2,DP分別為0.839 6和0.903 5,這些群體遺傳學參數(shù)表明這2個基因座具有很好的遺傳多態(tài)性和個體識別能力,鑒于中國東北馬鹿的養(yǎng)殖數(shù)量不足萬計,本研究 CM41S16和CM12S18 2個基因座有足夠的群體生物鑒別能力。在東北馬鹿鹿藥材的生物識別應用中具有較高的實用價值。因中國東北馬鹿養(yǎng)殖種群數(shù)量較小,故本研究群體數(shù)量偏小,造成基因頻率偏低的等位基因不能調查計算在內,可按照稀有等位基因,頻率以該基因座最小的等位基因頻率取值。