抗炎合劑對膿毒血癥大鼠胃腸黏膜屏障功能的影響*

李萬義, 閻國良

(上海市中醫醫院 急診科, 上海 200071)

膿毒血癥(膿毒癥)是指由感染引起的全身炎癥反應綜合征,嚴重者可導致器官急性功能障礙,誘發膿毒血癥性休克［1-2］。消化系統被認為是多器官功能障礙綜合征的啟動器官和急危重病應激的“中心器官”,有效防治胃腸屏障功能障礙是減少膿毒癥患者病死率的關鍵［3-4］。中醫認為膿毒血癥屬于“溫病”“熱病”“厥脫證”等范疇,其發病與感受邪毒、毒瘀內阻等密切相關［5-6］,本研究通過建立膿毒血癥大鼠模型,探究抗炎合劑對胃腸黏膜屏障的影響,為中醫藥在臨床上的應用提供實驗支持。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 72只SD 大鼠,體質量183～219 g、平均(202.97±7.35)g,8周齡,購于上海市中醫醫院,實驗動物使用許可證號SYXK(滬)2020-0014。

1.1.2主要試劑與儀器 抗炎合劑組成:生大黃9 g(后下)、黃芩20 g、黃連6 g、厚樸12 g、敗醬草30 g,由上海中醫醫院提供。頭孢哌酮舒巴坦(國藥準字H20020598,輝瑞制藥有限公司,規格3.0 g),白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及干擾素γ(INF-γ)酶聯免疫試劑盒購于上海廣銳生物科技有限公司(貨號分別為R-811、R-1389及ER5008-1),D-乳酸及膽囊收縮素(CCK)酶聯免疫試劑盒均購于上海科順生物科技有限公司(貨號分別為KS13858及KS10747),內毒素(ET)試劑盒購于上海鈺博生物科技有限公司(貨號yb-E12516),兔抗大鼠緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)及腸上皮咬合蛋白(Occludin)一抗購自美國Abcam公司(貨號ab307799及ab216327);EnVision多功能酶標儀(英國鉑金埃爾默公司),HM355S全自動輪轉式石蠟切片機(上海聚慕醫療器械有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1模型建立與分組 從72只SD大鼠中隨機選取18只作為對照組,切開腹腔翻找盲腸后關閉腹腔;其余54只大鼠參考文獻［7］采用盲腸結扎穿孔法建立膿毒血癥模型,麻醉采用2%戊巴比妥鈉按 3 mL/kg腹腔注射,開腹,盲腸根部結扎盲腸、腸系膜血管,穿刺針貫通穿刺3次形成盲腸漏,盲腸還納并逐層縫合腹腔,術后禁食12 h,自由飲水。術后6 h檢測大鼠肛溫、心率及呼吸頻率,肛溫>39 ℃、心率及呼吸頻率均升高為建模成功。建模過程中1只大鼠于灌胃過程中死亡, 53只模型大鼠隨機分為模型組、抗炎合劑組各18只,陽性對照組17只。

1.2.2藥物干預 參照人與大鼠的藥物換算系數［8］,所有大鼠均于建模前72 h開始相應藥物灌胃至術后6 h判定建模成功:抗炎合劑組大鼠給予抗炎合劑9 mL/(kg·d),生藥濃度為1 g/mL;陽性對照組大鼠給予頭孢哌酮舒巴坦0.2 g/(kg·d),對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.3標本采集 建模后24 h時麻醉所有大鼠,取腹主動脈血5 mL,3 000 r/min離心分離血清、-20 ℃貯存備用;無菌切取回盲部向上2.5 cm腸段冷藏備用,用于檢測腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達;另取部分大鼠小腸組織多聚甲醛固定、HE染色觀察小腸組織學變化。參考文獻［9］稱取建模后的大鼠降結腸糞便,計數大腸桿菌及乳酸桿菌菌落數。

1.3 觀察指標

1.3.1血清INF-γ、IL-1β及TNF-α、D-乳酸、CCK、ET水平檢測 血液樣本3 000 r/min離心15 min分離血清,采用酶聯免疫法檢測血清INF-γ、IL-1β、TNF-α、D-乳酸及CCK水平,采用放射免疫分析法檢測ET水平,具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.2小腸組織學觀察 取“1.2.3”項中固定好的小腸組織,酒精梯度脫水后加入二甲苯溶液進行透明處理、石蠟包埋,切成4 μm的薄片,HE染色后中性樹脂封片,于光學顯微鏡下觀察小腸組織學變化。

1.3.3糞便大腸桿菌及乳酸桿菌菌落計數 取100 mg大鼠降結腸糞便加入適量生理鹽水,制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7kg/L濃度梯度的混懸液,分別培養24、36 h后計數大腸桿菌及乳酸桿菌菌落數。

1.3.4小腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達 取部分小腸組織,充分研磨、裂解液裂解,BCA法定量蛋白濃度。取樣本50 μg,與4倍體積上樣緩沖液混合后上樣,金屬浴5 min,離心取上清,恒壓下電泳;濕轉至膜,封閉液常溫封閉2 h,TBST清洗,加入兔抗大鼠ZO-1、Occludin一抗(1∶500),4 ℃搖床孵育過夜、洗滌,加入山羊抗兔二抗(1∶2 000),室溫孵育1 h,暗室中曝光、顯影、定影,凝膠成像系統掃描,檢測ZO-1、Occludin蛋白表達水平。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 血清INF-γ、IL-1β及TNF-α、D-乳酸、CCK、ET水平

結果顯示,模型組大鼠血清INF-γ、IL-1β及TNF-α、D-乳酸、CCK、ET水平水平高于對照組(P<0.05),抗炎合劑組與陽性對照組大鼠血清INF-γ、IL-1β、TNF-α、D-乳酸、CCK、ET水平低于模型組(P<0.05),陽性對照組大鼠血清INF-γ、IL-1β、TNF-α、D-乳酸、CCK、ET水平低于抗炎合劑組(P<0.05),差異有統計學意義。見表1、表2。

表1 各組大鼠血清INF-γ、IL-1β及TNF-α水平比較

表2 各組大鼠血清D-乳酸、CCK、ET水平比較

2.2 糞便中大腸桿菌及乳酸桿菌菌落數

結果顯示,模型組大鼠降結腸糞便中大腸桿菌菌落數高于對照組、乳酸桿菌菌落數低于對照組(P<0.05),抗炎合劑組與陽性對照組大鼠降結腸糞便中大腸桿菌菌落數低于模型組、乳酸桿菌菌落數高于模型組(P<0.05),陽性對照組大鼠降結腸糞便中大腸桿菌菌落數低于抗炎合劑組、乳酸桿菌菌落數高于抗炎合劑組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠降結腸糞便中大腸桿菌及乳酸桿菌菌落數比較

2.3 大鼠小腸組織學觀察

結果顯示,對照組大鼠小腸組織結構完整,細胞形態正常,無明顯的病理學變化;模型組大鼠小腸組織細胞水腫明顯,可見大量炎癥細胞浸潤,部分細胞脫落壞死;抗炎合劑組及陽性對照組大鼠小腸細胞水腫減輕,少量炎癥細胞浸潤,未見明顯的壞死脫落細胞,其中陽性對照組改善程度更明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠小腸組織學觀察(HE,×200)

2.4 大鼠小腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達

結果顯示,模型組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達水平低于對照組(P<0.05),抗炎合劑組與陽性對照組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達水平高于模型組(P<0.05),陽性對照組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達水平高于抗炎合劑組(P<0.05),差異有統計學意義。見表4。

表4 各組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達

3 討論

膿毒血癥是重癥醫學面臨的重要問題,膿毒癥目前已成為重癥病房內非心血管疾病死亡的主要原因,研究發現,腸黏膜在膿毒癥中發揮重要作用,基礎研究顯示,膿毒癥大鼠胃腸黏膜會受到不同程度的損傷［10-11］。胃腸黏膜屏障包括:機械、化學、免疫、微生物等4大屏障,任何一道屏障的破壞或損傷都有可能引起膿毒血癥加重甚至死亡［12］。研究結果表明,胃腸黏膜屏障是預防膿毒血癥發生發展的重要因素,一般情況下,胃腸黏膜屏障功能障礙越重提示病情越重、預后越差［13］。胃腸屏障功能障礙可進一步引發全身炎癥反應綜合征及多器官功能障礙綜合征,因而研究胃腸屏障功能并改善其功能對于膿毒癥的治療具有重要的臨床價值。抗炎合劑的組方為大黃、黃芩、黃連、厚樸、敗醬草,組方配伍特點為苦寒并用以清熱,通腑活血以排毒,本研究旨在探究抗炎合劑對膿毒血癥胃腸道黏膜屏障功能的影響［14］。

研究認為,膿毒血癥會導致腸組織多項功能障礙,造成腸黏膜機械、化學、免疫、微生物屏障損傷,通透性增高,胃腸蠕動減弱,胃腸道內微生物環境惡化,細菌代謝產物入血,免疫受損。分析原因為,膿毒血癥患者胃腸道消化排空功能減弱,以大腸桿菌為主的條件致病菌將過度聚積并大量繁殖,破壞正常的微生物環境,與厭氧菌爭奪營養,一定程度上影響乳酸桿菌的繁殖［15-16］。中醫學認為苦寒藥物藥性寒涼,苦能燥濕傷陰,寒能傷陽,苦寒中藥進入機體時,在腸道內不可避免與腸道菌群相互作用［17-18］。研究發現苦寒中藥不僅對生理性腸道菌群結構有影響,還對病理性腸道菌群結構有調節作用［19］。本研究結果顯示,抗炎合劑組大鼠大腸桿菌菌落數明顯降低,乳酸桿菌菌落數明顯恢復,說明抗炎合劑可改善腸道菌群數量。現代臨床藥理學和基礎研究證實,大黃等可清除腸道內的細菌ET,抑制細胞因子的分泌,阻斷全身炎癥反應,減輕病理過程,并加強胃腸營養的支持,有利胃腸道功能的恢復,加速病情好轉［20-21］。黃連可調節藥源性小鼠腸道菌群失調癥,腸道中乳桿菌、雙歧桿菌等有益菌數量明顯增多［22］。黃芩苷能夠調節細菌物種豐度、多樣性指標以及乳桿菌數目,促進有益細菌的生長,調節腸道微生物環境［23-24］。黃連、黃芩、大黃等苦寒中藥進入機體時,在腸道內不可避免與腸道菌群相互作用,本研究使用的抗炎合劑主要成分為生大黃、黃芩、黃連等,結果與上述研究相符,特別是綜合用藥更能夠抑制炎癥反應,改善胃腸功能,調節腸道菌群結構,對膿毒癥大鼠的小腸組織起到一定的保護作用。

ET是反映腸道屏障功能的重要指標,當腸道黏膜上皮完整性被破壞時將移位進入血液循環,導致全身炎癥反應。腸道上皮細胞連接是否緊密與胃腸黏膜屏障功能密切相關［25］。ZO-1具有緊密連接形成的裝配平臺作用,其通過將細胞骨架與閉鎖蛋白連接在一起形成穩定的連接系統,Occludin作為封閉相鄰內皮細胞與上皮細胞之間間隙的重要成分,可直接反映胃腸黏膜屏障功能［26］。本研究結果顯示,抗炎合劑組血清D-乳酸、CCK、ET水平低于模型組,小腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達水平高于模型組,提示抗炎合劑可有效改善胃腸黏膜屏障功能。

綜上所述,抗炎合劑能夠改善膿毒血癥大鼠炎癥反應及胃腸黏膜屏障,維持腸道菌群平衡,對大鼠小腸組織具有一定的保護作用。但其內在機理及療效尚有待進一步研究。