天鉤平肝顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

徐 偉，周 茜，王靖雯，范潤(rùn)勇，蒲立立，張 明，楊云芝△

（1. 四川省南充市中醫(yī)醫(yī)院，四川南充 637000； 2. 四川省南充市食品藥品檢驗(yàn)所，四川南充 637000）

天鉤平肝湯（煎劑）為四川省名老中醫(yī)徐仕宏的經(jīng)驗(yàn)方，由《雜病證治新義》中的天麻鉤藤飲和《金匱要略》中的澤瀉湯加減而成，具有平抑肝陽及滲濕利尿功效，臨床用于治療肝陽上亢型高血壓所引起的頭痛、眩暈、耳鳴、眼花、震顫、失眠等癥狀。天麻鉤藤飲和澤瀉湯均可降低肝陽上亢型自發(fā)性高血壓模型大鼠的血壓［1］，以及改善高血壓模型小鼠的氧化應(yīng)激和炎癥［2-3］；澤瀉湯還可通過相關(guān)信號(hào)通路降低鹽敏感性高血壓模型大鼠的血壓［4-6］。由于煎劑存在煎煮煩瑣、攜帶與儲(chǔ)存不便、患者依從性差等問題，故在不改變?cè)形镔|(zhì)基礎(chǔ)的前提下，我院擬將天鉤平肝湯開發(fā)為顆粒劑。本研究中擬采用薄層色譜（TLC）法對(duì)制劑組方藥材中的川芎、首烏藤和葛根進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)煎劑、顆粒及其藥材樣品中的天麻素、梔子苷、葛根素、黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，以為制訂天鉤平肝顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；AUW220D 型分析天平（日本Shimadzu 公司）；FA2004 型分析天平（上海力辰科技儀器有限公司）；TD5A型醫(yī)用離心機(jī)（常州市金壇高科儀器廠）；G-100S型超聲波清洗器（深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司）；ZF - 2 型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）；RE - 1102 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海嘉鵬科技有限公司）；SYG-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵（上海力辰科技儀器有限公司）；WGL-45B型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；LCK2000 型煎藥機(jī)（天津三延精密機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

天鉤平肝湯（醫(yī)院中藥房自制，編號(hào)分別為J220501，J220502，J220503；均含天麻10 g、炒梔子15 g、葛根30 g、酒黃芩15 g 等，每份500 mL）；天鉤平肝顆粒（醫(yī)院中藥制劑中心，批號(hào)分別為220501，220502，220503，規(guī)格為每袋15 g）；天麻素對(duì)照品（批號(hào)為110807-202010，含量95.5%），梔子苷對(duì)照品（批號(hào)為110749-201919，含量97.1%），葛根素對(duì)照品（批號(hào)為110752-201816，含量95.4%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715-202122，含量94.2%），大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110756-201913，含量96.0%），川芎對(duì)照藥材（批號(hào)為120918 - 201813），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為怡寶純凈水；天麻（批號(hào)分別為200501，200601，200701），炒梔子（批號(hào)分別為200401，200501，200701），葛根（批號(hào)分別為201201，210301，210401），酒黃芩（批號(hào)分別為200501，200601，200701），首烏藤（批號(hào)分別為200401，200501，200601），川芎（批號(hào)分別為210601，210701，210901），其他原料藥材，均購(gòu)自成都吉安康藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

川芎：取煎劑樣品25 mL，加乙酸乙酯萃取3 次，每次20 mL，合并有機(jī)相，水浴蒸干，加2 mL甲醇溶解固形物，即得供試品溶液Ⅰ。取顆粒樣品10 g，加乙酸乙酯60 mL，超聲（功率250 W、頻率40 kHz，下同）提取30 min，濾過，濾液水浴蒸干，加2 mL 甲醇溶解固形物，即得供試品溶液Ⅱ。取川芎對(duì)照藥材粉末0.5 g，精密稱定，加乙酸乙酯30 mL，超聲提取40 min，濾過，濾液水浴蒸干，固形物加2 mL 甲醇溶解，即得對(duì)照藥材溶液。按天鉤平肝顆粒處方和工藝制備缺川芎的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典（一部）》TLC 法［7］42，吸取上述溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（5∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖1，1'.Negative reference solution 2，2'.Reference medicinal material solution or reference solution 3-5.Test solution Ⅰ（numbers：J220501，J220502，J220503） 6-8.Test solution Ⅱ（batch numbers：220501，220502，220503）A.Chuanxiong Rhizoma B.Polygoni Multiflori Caulis C.Puerariae Lobatae RadixFig.1 TLC chromatograms

首烏藤：取大黃素對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的對(duì)照品溶液。按川芎鑒別項(xiàng)下方法制備缺首烏藤的陰性樣品，并制備陰性對(duì)照品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典（一部）》TLC法［7］277，吸取上述溶液及川芎鑒別項(xiàng)下供試品溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶1∶0.1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 B。

葛根：取葛根素對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的對(duì)照品溶液。按川芎鑒別項(xiàng)下方法制備缺葛根的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）TLC法［7］347，吸取上述溶液及川芎鑒別項(xiàng)下供試品溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-甲醇-甲酸（4∶1∶0.2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

天麻素：色譜柱為Agilent Zorbax SB - Phenyl 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（6∶94，V/V）；流速為1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

梔子苷、葛根素、黃芩苷：色譜柱同上；流動(dòng)相為乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～18 min 時(shí)12%A，18～30 min 時(shí)12%A→27%A，30～45 min 時(shí)27%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：分別取天麻素對(duì)照品10.62 mg 和梔子苷對(duì)照品8.90 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為101.42，86.42 μg/ mL 的單一對(duì)照品溶液；分別取葛根素對(duì)照品15.50 mg 和黃芩苷對(duì)照品13.27 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解（配置葛根素溶液需先加熱至65 ℃，溶解后冷卻至室溫），定容，制成質(zhì)量濃度分別為591.48，500.01 μg/ mL 的單一對(duì)照品溶液。分別精密吸取梔子苷、葛根素、黃芩苷對(duì)照品溶液8.68，3.00，10.00 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為15.00，35.49，100.00 μg/ mL 的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取煎劑樣品5 mL，加水定容至25 mL，吸取5 mL，再加水定容至25 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液Ⅲ；取顆粒樣品2 g，精密稱定，加水定容至25 mL，超聲提取40 min，4 000 r/min離心15 min，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液Ⅳ。

陰性對(duì)照品溶液：按天鉤平肝顆粒處方和工藝制備缺天麻、炒梔子、葛根、酒黃芩的單一陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得單一陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液Ⅳ、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖2、圖3。

圖2 天麻素的高效液相色譜圖1.Gastrodin A.Reference solution B.Test solution Ⅳ C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of gastrodin

圖3 梔子苷、葛根素、黃芩苷的高效液相色譜圖1.Geniposide 2.Puerarin 3.Baicalin A.Mixed reference solution B.Test solution Ⅳ C.Negative reference solution lacking stir - fried Gardeniae Fructus D.Negative referencesolution lacking Puerariae Lobatae Radix E.Negative reference solution lacking wine - processed Scutellariae RadixFig.3 HPLC chromatograms of geniposide，puerarin and baicalin

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2.2項(xiàng)下天麻素對(duì)照品溶液0.125，0.25，0.5，1，2，4，6 μL，混合對(duì)照品溶液0.5，1，2，4，6，8，10，12 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程及線性范圍。詳見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test

精密度試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下天麻素對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果天麻素、梔子苷、葛根素、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.95%，0.17%，0.15%，1.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，12，24 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果天麻素、梔子苷、葛根素、黃芩苷峰面積的RSD分別為2.53%，1.85%，0.32%，1.97%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品適量，各6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果天麻素、梔子苷、葛根素、黃芩苷含量的RSD分別為1.77%，0.69%，0.45%，2.32%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的單一對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取煎劑及顆粒樣品各適量，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行3次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 煎劑、顆粒待測(cè)成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/mL，n=3）Tab.3 Results of the content determination of components to be determined in decoction and granules（mg/mL，n=3）

2.2.5 待測(cè)成分轉(zhuǎn)移率

按藥典方法提取天麻、炒梔子、葛根、酒黃芩藥材樣品中的活性成分，并按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算天麻素、梔子苷、葛根素、黃芩苷的含量；按各批次煎劑和顆粒對(duì)應(yīng)的每克生藥提取量計(jì)算各活性成分的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表4。

表4 目標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of transfer rate determination of target components（n=3）

3 討論

天鉤平肝湯由天麻、鉤藤、石決明、炒梔子、酒黃芩、葛根、川芎、首烏藤、白術(shù)、澤瀉、羅布麻葉、炒酸棗仁等組方，預(yù)試驗(yàn)中對(duì)顆粒樣品中的天麻、鉤藤、酸棗仁、白術(shù)、川芎、首烏藤、葛根、紅花進(jìn)行TLC［7］鑒別。其中，鉤藤中的異鉤藤堿及白術(shù)中的蒼術(shù)酮未檢出；天麻中的天麻素，酸棗仁中的酸棗仁皂苷A 和酸棗仁皂苷B，紅花中的羥基紅花黃色素A因分離效果差，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，顯色不明顯，故均未納入。川芎、首烏藤、葛根的TLC鑒別結(jié)果顯示，其斑點(diǎn)顯色清晰，分離度較好，可進(jìn)行優(yōu)化研究。故在藥典方法基礎(chǔ)上改進(jìn)為本研究中的條件，結(jié)果目標(biāo)斑點(diǎn)成點(diǎn)性好，顯色清晰、明亮、易觀察，陰性對(duì)照無干擾。

天鉤平肝顆粒組方中的天麻可抑制血壓升高［8］，活性成分天麻素的注射液聯(lián)合常規(guī)治療可降低患者的收縮壓和舒張壓［9］；梔子提取物可降壓［10-11］；葛根總黃酮可顯著降低血壓和降低腦血管阻力［12］，葛根素可降低模型大鼠的收縮壓和舒張壓［13］；黃芩苷可擴(kuò)張血管［14-15］。故本研究中選用天麻素、梔子苷、葛根素、黃芩苷作為含量測(cè)定指標(biāo)。預(yù)試驗(yàn)中考察了梔子苷（238 nm）、葛根素（250 nm）、黃芩苷（280 nm）在其最大吸收波長(zhǎng)處的其他目標(biāo)峰峰面積，當(dāng)波長(zhǎng)為238 nm 時(shí)，雜質(zhì)峰干擾小，各目標(biāo)峰峰面積較理想；考察了不同類型色譜柱（Agilent Zorbax SB-C18柱、Agilent Eclipse XDB-C18柱、Agilent Zorbax SB - Phenyl 柱），不同溶劑系統(tǒng)（甲醇-水、甲醇- 0.1%磷酸溶液、乙腈- 0.1%磷酸溶液）對(duì)天麻素、梔子苷、葛根素、黃芩苷與雜質(zhì)色譜峰分離效果的影響，結(jié)果在本研究中色譜條件下供試品溶液色譜峰峰形較好，峰寬小，分離度大于1.5，理論板數(shù)大于5 000，拖尾因子為0.95～1.10。

本研究中對(duì)天鉤平肝煎劑、顆粒及其所用原料中天麻素、梔子苷、葛根素和黃芩苷的含量進(jìn)行測(cè)定，確定煎劑與顆粒中各活性成分的含量和轉(zhuǎn)移率。結(jié)果證實(shí)，天鉤平肝顆粒轉(zhuǎn)移率明顯優(yōu)于其煎劑。根據(jù)顆粒樣品中每袋所含藥材的生藥量，對(duì)天鉤平肝顆粒中待測(cè)成分含量進(jìn)行限定，每袋含天麻素、梔子苷、葛根素、黃芩苷分別不得低于1.1，19.7，56.9，102.2 mg。

綜上所述，本研究中建立了天鉤平肝煎劑和顆粒中川芎、首烏藤、葛根的定性鑒別方法及主要功效成分的含量測(cè)定方法，精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠；同時(shí)，依據(jù)轉(zhuǎn)移率和原料藥材活性成分限量對(duì)天鉤平肝顆粒各活性成分含量進(jìn)行了限定，可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。