骨橋蛋白和鐵調素在干燥綜合征及狼瘡患者組織中的表達

劉娟 郭華 孫敏 付萍

[摘要]目的：通過蛋白芯片技術篩選血清中的2個結果蛋白做免疫組化（Immunohistocry，IH）研究，檢測其在干燥綜合征（Sj?grens syndrome，SS）患者唇腺組織、系統性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）患者皮損及狼瘡性腎炎（Lupus nephritis，LN）患者腎臟組織中的表達情況。方法：收集2004年1月-2013年12月就診于風濕免疫科患者的組織蠟塊43例，按照不同疾病、不同部位將組織蠟塊分為SS組16例、非SS對照組10例、SLE皮損組9例、LN組8例。采用免疫組織化學染色法檢測骨橋蛋白和鐵調素在SS患者、SLE患者皮損和LN患者腎臟組織中的表達。使用Fromowitz的綜合計分法進行結果判定。陽性率的比較采用四格表確切概率法。結果：骨橋蛋白和鐵調素在SS唇腺組織的表達均高于非SS唇腺組織，兩種蛋白在SLE皮損中未液化的少量基底層細胞中見陽性表達、狼瘡腎組織中腎小管上皮細胞見陽性表達。結論：骨橋蛋白與鐵調素可在干燥綜合征患者唇腺組織、系統性紅斑狼瘡患者皮損及狼瘡性腎炎患者的腎小管中表達。

[關鍵詞]干燥綜合征；免疫組化；骨橋蛋白；鐵調素；系統性紅斑狼瘡

[中圖分類號]R365? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）05-0096-04

The Expression Both of Osteopontin and Hepcidin in the Tissue of Sj?grens Syndrome and Systemic Lupus Erythematosus Patients

LIU Juan1，GUO Hua1，SUN Min1，FU Ping2

（1.Department of Dermatology，Huishan People's Hospital of Wuxi，Wuxi 214187，Jiangsu，China; 2.Department of Rheumatology and Immunology，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，Yunnan，China）

Abstract： Objective? The immunohistochemical method was applied to text two proteins screened through SELDI-TOF-MS from serum. To test the expression in the labial gland tissue of SS patients，the skin lesion of Systemic Lupus Erythematosus and renal tissue in LN patients. Methods? Collection forty-three tissue wax blocks from the patients who treated in the department of rheumatology and immunology during January 2004 to December 2013. The tissue wax blocks were divided into SS group（n=16）， non-SS control group（n=10）， SLE skin lesion group（n=9）and LN group（n=8） accord different disease and different position.Used the immunohistochemical staining to test the expression in the labial gland tissue of SS patients， the skin lesion of Systemic Lupus Erythematosus and renal tissue in LN patients.Used the Fromowitz comprehensive scoring method to assess the results. The comparison of two kinds of protein staining positive rate used the four table exact probability. Results? Osteopontin and hepcidin in the expression of SS labial gland tissue were higher than non-SS labial gland tissue， was detected in the lesions of SLE did see positive expression in a small amount of liquid base layer cells， lupus kidney tissues in renal tubular did see positive expression. Conclusion? Osteopontin and hepcidin were expressed in labial gland tissue of SS， skin lesion of SLE and lupus kidney patientsrenal tubules of LN.

Key words： sj?grens syndrome; immunohistochemical; osteopontin; hepcidin; systemic lupus erythematosus

SS是一種以淋巴細胞浸潤累及全身外分泌腺，主要侵犯淚腺和唾液腺為主的彌漫性慢性自身免疫性疾病。骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是具有多種功能的分泌型鈣結合磷酸化糖蛋白，OPN可表達于巨噬細胞、中性粒細胞、DC、T、B淋巴細胞等作為一種前炎性細胞因子，參與免疫反應[1]。OPN與SLE相關研究已有報道，但與SS相關研究報道較少；鐵調素（Hepcidin，Hepc）是鐵代謝的主要調節(jié)激素，目前OPN和Hepc在干燥綜合征的研究中報道較為罕見。本研究通過蛋白芯片技術篩選血清中的2個結果蛋白進一步做唇腺組織免疫組化研究，檢測其在SS患者唇腺組織、SLE患者皮損及LN患者腎臟組織中的表達情況。現將結果報道如下。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料：收集2004年1月-2013年12月就診于昆醫(yī)附二院滿足2002年國際分類標準確診為干燥綜合征16例患者的唇腺蠟塊作為SS組，男1例，女15例，年齡20～72歲，平均年齡（46.94±13.57）歲；收集2004年1月-2013年12月就診于昆醫(yī)附二院患者做唇腺活檢為正常唇腺組織的唇腺蠟塊，即不符合SS診斷標準的唇腺組織蠟塊10例，作為非SS對照組，男3例，女7例，年齡44～68歲，平均年齡（57.78±8.35）歲，兩組患者在年齡、性別上對比，差異無統計學意義；收集滿足2009年美國風濕協會SLE診斷標準確診為系統性紅斑狼瘡患者的皮損蠟塊9例，作為SLE皮損組：男1例，女8例，年齡12～59歲，平均年齡（35.44±15.85）歲；狼瘡性腎炎腎臟組織蠟塊8例作為LN組：男3例，女5例，年齡16～45歲，平均年齡（26.0±9.34）歲，兩組患者在年齡、性別上對比，差異無統計學意義。

1.2 試驗試劑：一抗為兔抗骨橋蛋白抗體（BYK-0019R）和兔抗鐵調素抗體（BYK-8870R），均采購于上海博研生物有限公司（Abcam）；二步法抗為兔鼠通用型免疫組化試劑盒（GK500710，Gene Tech）。

1.3 方法：骨橋蛋白、鐵調素免疫組織化學染色采用Envision二步法。以PBS液代替一抗的免疫組織化學染色的結果為陰性對照；以唇腺腺泡細胞、導管細胞和腎小管細胞胞漿著色作為OPN與Hepc的判斷依據；結果評估參照Fromowitz的綜合計分法進行，進行雙盲半定量分析。以細胞膜或胞漿出現明顯的棕黃色顆粒為陽性細胞，無著色或與背景顏色一致為陰性細胞。隨機選擇5個高倍鏡視野，計數滋養(yǎng)細胞總數和陽性細胞總數，得出陽性細胞百分率及計分。無陽性細胞為0分，陽性細胞百分率1%～25%為1分，26%～49%為2分，≥50％為3分；根據多數細胞的著色強度計算強度得分，無著色為0分，淺棕褐色為1分，棕褐色為2分，深棕褐色為3分；陽性率和強度計分相加后的結果：0～1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）。

1.4 統計學分析：采用SPSS 13.0軟件進行數據的統計學處理。樣本OPN表達陽性率的比較采用Fisher確切概率法。

2? 結果

2.1 SS組、非SS組唇腺組織中OPN的免疫組化染色結果：SS組骨OPN免疫組化的組織切片可見在導管上皮細胞和腺泡細胞（主要為導管上皮細胞）的胞漿中有棕黃色顆粒即呈陽性表達，少量基底層細胞也存在陽性表達；非SS組在部分導管上皮細胞和腺泡細胞上皮細胞胞漿中可見淡黃色顆粒；SS唇腺的陰性對照片無陽性表達。見圖1。

2.2 SS組、非SS組唇腺組織中Hepc的免疫組化染色結果：SS組Hepc免疫組化的組織切片可見在導管上皮細胞和腺泡細胞（主要為導管上皮細胞）胞漿中有棕黃色顆粒即呈陽性表達，少量基底層細胞也有陽性表達；非SS組在部分導管上皮細胞和腺泡細胞上皮細胞胞漿中可見淡黃色顆粒；SS唇腺的陰性對照片無陽性表達。見圖2。

2.3 OPN和Hepc在SS組唇腺組織陽性率的統計分析：SS組唇腺組織中OPN的陽性率為87.5%（14/16），Hepc的陽性率為81.3%（13/16），OPN和Hepc的陽性率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。在非SS組中OPN和Hepc的陽性率均為30.0%（3/10）。OPN在SS組陽性率高于非SS組中（P＜0.05），Hepc在SS組陽性率高于非SS組（P＜0.05）。16例SS中有12例共同表達OPN和Hepc。見表1。

2.4 SLE皮損中OPN和Hepc的免疫組化染色結果：OPN和Hepc在SLE皮損未液化的少量基底細胞中均可見陽性表達，差異無統計學意義，汗腺導管上皮細胞未見陽性表達。見圖3。

2.5 LN組腎臟組織中OPN和Hepc的免疫組化染色結果：OPN和Hepc在LN狼瘡腎臟組織的大量腎小管上皮細胞中均可見陽性表達，腎小球中無表達。見圖4。

2.6 OPN和Hepc在LN組腎臟組織陽性率的統計分析：LN組腎臟組織中OPN的陽性率為62.5%，Hep的陽性率為75.0%，OPN和Hepc的陽性率差異無統計學意義（P＞0.05）。8例SS中有5例共同表達OPN和Hepc。見表2。

2.7 在OPN及Hepc兩組蛋白的LN組腎臟組織每張切片中各選5張400×的視野圖，算出100個細胞中陽性細胞的個數，并算出均值，對兩組進行相關性分析，從輸出的散點圖可看出兩個變量有線性趨勢，其線性回歸方程為y=0.995x+1.776，可認為OPN在腎小管上皮細胞的表達量與Hepc在腎小管上皮細胞的表達量呈正相關。見圖5。

3? 討論

干燥綜合征是以淋巴細胞對外分泌腺浸潤為特征的自身免疫性疾病，主要產生IFN-γ的Th1細胞在SS患者的唇腺組織被發(fā)現，這些細胞刺激T、B淋巴細胞和巨噬細胞的活化，引起腺體結構破壞和功能障礙。

OPN是一種具有多種功能的分泌型鈣結合磷酸化糖蛋白，分布于多種組織，也可表達于多種免疫細胞如巨噬細胞、DC和淋巴細胞中，在免疫系統的疾病進程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[2]。此前研究表明，應用SELDI檢測干燥綜合征患者的特異性差異蛋白中有骨橋蛋白[3]。王玉華[4]發(fā)現SS患者唇腺組織及浸潤的淋巴細胞胞漿中OPN的mRNA轉錄和蛋白表達水平顯著增高，吳國琳發(fā)現干燥綜合征患者血清和唾液腺組織OPN表達增加[5]，本研究結果顯示OPN在腺泡細胞和導管上皮細胞均有表達，提示OPN參與了SS的發(fā)病過程，但其機制不清。分析原因可能為，OPN在炎性刺激物的誘導下使Th細胞向Th1、Th2或Th17細胞偏移，同時OPN也是多克隆B細胞活化因可刺激巨噬細胞增殖活化，誘導前炎性細胞因子的分泌，引起組織損傷[6]，而B細胞是SS發(fā)病必不可少的因素，OPN可能通過多種方式誘發(fā)或加重了SS。

在米向斌[7]的研究中，活動期SLE患者血清中OPN水平明顯增高，SLEDAI（SLE疾病活動指數）與血清OPN水平呈明顯正相關；但是非活動期SLE患者和健康對照組血清OPN水平比較差異無統計學意義。而且，血清OPN水平與IL-17水平呈明顯正相關。另一研究顯示SLE患者血漿中OPN水平較正常健康人群顯著增高，且處于活動期的SLE患者血漿OPN水平顯著高于穩(wěn)定期[8]。本實驗中OPN在SLE皮損未液化的少量基底細胞中可見陽性表達。目前在基因層面Kaleta等[9]的研究表明，OPN_rs1126616 的雜合或純合突變（707C/T）的個體具有更高的SLE易感性。國內研究表明，OPN基因的rs1126772、rs11728697和rs4754位點SLE發(fā)病風險無關[10]。SLE患者OPN基因rs9138和rsl1730582位點與SLE發(fā)病風險無關[11]。這些結果說明OPN的產生和SLE的炎性損傷和疾病進展密切相關其具體發(fā)病機制及致病基因位點有待進一步研究。

有實驗研究在MRL/1pr小鼠狼瘡腎炎的進展中顯示，OPN可通過激活巨噬細胞和B細胞起重要作用，OPN在腎小管的表達可能提示狼瘡性腎炎患者預后不良[12]。研究證實[5]OPN在LN腎小管的表達水平與正常腎組織相比有明顯增高，尤以IV型LN為甚，其表達量與腎臟病理活動指數、腎損害臨床指標及疾病活動度相一致。LN活動期患者血清中OPN水平高于緩解期[13]。OPN誘導的自身炎癥反應間接促進補體C3的消耗，C3主要沉積于腎小球基底膜，參與腎小球的損害，從而導致OPN間接參與腎小球的損害[14]。本研究顯示OPN僅在在LN患者的腎小管上皮細胞表達而在腎小球不表達，提示OPN可能不是LN發(fā)病的主要參與者，而是間接參與腎小球的損害，與上述研究一致。

鐵調素是一種主要從肝臟合成的小肽，在腦、心臟、巨噬細胞、脂肪細胞也有少量的表達，經過剪切修飾等改變后具有25個氨基酸且存在生物活性。Hepc是一種II型急性期蛋白，與炎癥、貧血和鐵代謝的調節(jié)具有相關性[15]。在RA患者中由于IL-6的刺激和誘導作用，BMP-6及Hepc失去了對貧血和鐵代謝的正常感應及調節(jié)作用，導致鐵代謝紊亂及單純性慢性病性貧血的發(fā)生[16]。在SLE患者中IL-6可通過STAT3途徑和 HJV-BMP/SMAD信號通路調節(jié)Hepc的表達。有研究通過檢測92例狼瘡女患者的血清Hepc，得出血清Hepc與狼瘡活動相關，可作為監(jiān)測狼瘡活動的指標[17]。尿液Hepc在LN患者組中的表達水平明顯高于SLE無腎炎組和健康對照組；尿液Hepc在活動期LN患者組中表達水平顯著高于靜止期LN組，表明LN患者的尿液Hepc與SLEDAI評分呈正相關[18]。本研究結果顯示Hepc在SS組和非SS組均有導管上皮細胞和腺泡細胞不同程度的表達，但與腎臟損傷沒有明確的相關性，推測Hepc可能不是SS發(fā)病的驅動因素，可能是繼發(fā)于損傷、感染和炎癥刺激等引起Hepc基因的強烈表達的結果，這一假設有待今后繼續(xù)研究。SLE患者血清Hepc與狼瘡活動相關。尿液中Hepc在SLE腎臟受累的患者中表達水平升高，與本實驗Hepc在SLE皮損未液化的少量基底細胞可見陽性表達；Hepc在LN狼瘡腎臟組織的大量腎小管上皮細胞中可見陽性表達，提示Hepc可能是一種新的反映LN活動性的指標。

[參考文獻]

[1]Lund S A，Giachelli C M，Scatena M.The role of osteopontin in inflammatory processes[J].J Cell Commun Signal，2009，3（3-4）：311-322.

[2]Spinelli F R，Garufi C，Truglia S， et al.The role of osteopontin as a candidate biomarker of renal involvement in systemic lupus erythematosus[J].Clin Exp Rheumatol，2019，37（6）：899-905.

[3]劉娟，付萍.干燥綜合征蛋白組學的研究[J].昆明醫(yī)科大學學報，2016，37（4）：65-70.

[4]王玉華，趙綿松，趙巖.舍格倫綜合征患者唇腺組織中骨橋蛋白的表達[J].臨床口腔醫(yī)學雜志，2011，27（10）：579-581.

[5]Wu G L，Li T Y，Fan Y S，et al.Therapeutic effect of Chinese herbal medicine for strengthening qi，nourishing yin，and removing stasis on serum osteopontin and quality of life of patients with primary Sjogren's syndrome[J].Chin J Integr Med，2011，17（9）：710-714.

[6]Scatena M，Liaw L，Giachelli C M.Osteopontin：a multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27（11）：2302-2309.

[7]米向斌，羅妙旋，邱賢文，等.系統性紅斑狼瘡中白介素-27/骨橋蛋白調控軸在Th17細胞異常中的作用[J].中國皮膚性病學雜志，2014，28（8）：789-791.

[8]胡偉，生媛，徐學靜，等.血漿骨橋蛋白水平與系統性紅斑狼瘡疾病活動性及腎臟損害的相關研究[J].現代醫(yī)學，2017，45（11）：1591-1593.

[9]Kaleta B，Piotr M，Andrzej G，et al.The preliminary associ-ation study of osteopontin 707 C/T polymorphism with systemic lupus erythematosus in a Polish population[J].A Postepy Dermatol Alergol，2020，37（2）：190-194.

[10]陳新瑤，丁燕佳，梁雪雁，等.OPN基因多態(tài)性與潮汕人群女性SLE發(fā)病風險的相關性[J].分子診斷與治療雜志，2021，13（3）：360-363.

[11]石縫，韋玉霞，龐曉霞，等.骨橋蛋白SNPrs9138和rs11730582與女性SLE發(fā)病風險的相關性研究[J].臨床皮膚科雜志，2020，49（4）：195-199.

[12]Miyazaki T，Ono M，Qu W M，et al.Implication of allelic poly-morphism of osteopontin in the development of lupus nephritis in MRL/lpr mice[J].Eur J Immunol，2005，35（5）：1510-1520.

[13]李就鴻，張軍，黃佩珍，等.系統性紅斑狼瘡腎炎患者血清骨橋蛋白表達的意義[J].中國現代醫(yī)生，2012，50（34）：151-152.

[14]劉瓊，李向培，胡白，等.SLE患者血清、尿液和腎臟骨橋蛋白的檢測及臨床意義[J].中華皮膚科雜志，2010，43（1）：6-9.

[15]唐代榮，廖湘平，李志湘，等.鐵調素和狼瘡性腎炎的相關性研究進展[J].當代臨床醫(yī)刊，2017，3（1）：2881-2883.

[16]鄔秀娣，張振，陳勇，等.類風濕關節(jié)炎患者血清骨形態(tài)發(fā)生蛋白6和鐵調素與貧血的關系[J].浙江醫(yī)學，2013，35（18）：1632-1636.

[17]蘇雯慧，黃克智，聶大年.狼瘡患者的血清鐵調素水平與狼瘡活動的關系[J].醫(yī)藥界，2020，9（20）：161.

[18]唐代榮，謝先達，廖湘平.尿液中鐵調素在系統性紅斑狼瘡中的臨床意義[J].臨床腎臟病雜志，2017，17（8）：490-494.

[收稿日期]2021-12-27

本文引用格式：劉娟，郭華，孫敏，等.骨橋蛋白和鐵調素在干燥綜合征及狼瘡患者組織中的表達[J].中國美容醫(yī)學，2023，32（5）：96-99.