益腎安宮Ⅱ號對脾腎兩虛型復發性流產患者外周血可溶性Tim-3、Gal-9 表達水平的影響

張 偉 洪 洋 陳曉菲 王晨曄 丁彩飛

復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）的發生率達1%～5%[1]，是生殖健康領域的常見疾病。連續發生自然流產2 次與3 次的病因構成相似，且發生2 次自然流產后再發風險升高[2]，因此將妊娠28 周之前，與同一配偶連續發生2 次及以上的自然流產定義為RSA，并推薦將反復生化妊娠納入RSA 進行管理[3]。在妊娠過程中，T 細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（Tim-3）/半乳糖凝集素-9（Gal-9）信號通路調控母胎界面輔助性T 細胞1（Th1）/輔助性T 細胞2（Th2）及輔助性T 細胞17（Th17）/調節性T細胞（Treg）之間的平衡以維持母胎免疫耐受[4]，RSA的發生與母胎之間的免疫耐受異常密切相關[5]。本研究應用益腎安宮Ⅱ號對RSA 患者進行干預，檢測外周血可溶性Tim-3（sTim-3）、Gal-9 的表達水平，探討益腎安宮Ⅱ號治療RSA 的作用機制，為臨床應用益腎安宮Ⅱ號治療RSA 提供實驗依據，進一步豐富RSA 的治療手段，報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2020 年11 月至2022 年4 月就診于浙江省中西醫結合醫院生殖醫學科的RSA患者60 例，采用隨機數字表法分為治療組與對照組，每組30 例。選擇同時期就診的正常早孕期女性30 例為正常組。本研究經過醫院倫理委員會審核通過，審批號：[2020]研審第（41）號。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準 參照《復發性流產診治專家共識》[6]相關內容制定RSA 診斷標準：妊娠28 周前，自然流產連續發生2 次及以上。

1.2.2 中醫辨證標準 參考《中醫婦科學》[7]和《中藥新藥臨床研究指導原則》[8]中滑胎的相關內容制定，符合脾腎兩虛型：屢孕屢墮連續2 次及以上，神疲乏力，頭暈耳鳴，腰膝酸軟，精神萎靡，氣短，納差，大便溏，夜尿頻數，面色萎黃或白，眼眶黯黑或有黯斑，肌膚不潤，舌質淡嫩苔薄白，脈沉細滑，尺脈弱。

1.3 納入標準

1.3.1 RSA 組納入標準（1）符合西醫診斷及中醫辨證標準；（2）自然流產2 次及2 次以上；（3）孕周＜12 周；（4）丈夫無精液異常；（5）夫妻雙方無染色體異常；（6）無解剖結構異常；（7）無自身免疫性疾病；（8）無內分泌異常；（9）無感染因素；（10）無血凝分析異常。

1.3.2 正常組納入標準（1）既往正常足月分娩至少1 次且無自然流產史；（2）年齡與RSA 組相仿；（3）B 超提示宮內早孕，可見心管搏動。

1.4 排除標準（1）生殖道畸形；（2）急慢性感染期；（3）男方精液異常；（4）自身免疫性疾病；（5）近期服用過免疫抑制劑；（6）合并有糖尿病、高血壓、心臟病、肝腎疾病及血液疾病；（7）有吸煙及酗酒史；（8）近3 個月內有疫苗接種史；（9）未按規定服藥無法判斷療效，或資料不全影響療效判斷者。

2 方 法

2.1 治療方法 對照組口服地屈孕酮片（荷蘭蘇威制藥，批號H20020632）10 mg，每天3 次黃體支持治療，連續服用7 d 為1 個療程，直至孕12 周停藥。治療組加用益腎安宮Ⅱ號[鹽續斷、桑寄生、杜仲、炒黨參、熟地、炒白芍各15 g，菟絲子30 g，阿膠珠（烊兌）、茯苓、炒白術各12 g，甘草5 g]（杭州華東中藥飲片有限公司），水煎服，每天1 劑，分早晚溫服，連續服用7 d為1 個療程，直至孕12 周停藥。

2.2 檢測指標及方法 治療組及對照組分別于治療前、孕12 周時采集靜脈血3 mL，正常組于首次就診時采集靜脈血3 mL，在小試管中自然凝血后收集血清，-80 ℃保存待用。化學發光免疫法檢測血清孕酮（P）、雌二醇（E2）、人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）水平，酶聯免疫吸附試驗法檢測血清sTim-3、Gal-9 水平。

2.3 療效評定標準 參照《復發性流產診治專家共識》[6]及《中藥新藥臨床研究指導原則》[8]的相關內容修改制定：（1）治愈：妊娠超過28 周，孕28 周B 超示胎兒發育正常；（2）好轉：妊娠未超過28 周，但超過既往流產最大孕周，且既往流產孕周B 超示胚胎（胎兒）發育正常；（3）未愈：妊娠未超過既往流產最大孕周即發生流產，B 超檢查示胚胎發育不良或停止發育。總有效率=（治愈+好轉）例數/總例數×100%。

2.4 統計學方法 應用SPSS 21.0 軟件包進行統計分析。符合正態分布計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，治療前后比較采用配對樣本t 檢驗；計數資料用率（%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05 認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 三組研究對象一般資料比較 三組年齡、孕周比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 三組研究對象一般資料比較（）

表1 三組研究對象一般資料比較（）

注：治療組予達芙通聯合益腎安宮Ⅱ號口服；對照組予達芙通口服；正常組不予藥物治療

3.2 三組研究對象血清β-HCG、P、E2 水平比較治療前三組β-HCG、P、E2 水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療組與對照組β-HCG、E2 水平較治療前顯著上升（P＜0.05），且治療組上升更明顯（P＜0.05）。治療組P 水平較治療前上升（P＜0.05），對照組P 水平治療前后無明顯改變（P＞0.05）。治療后，治療組與對照組P 水平相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 三組研究對象血清β-HCG、P、E2 水平比較（）

表2 三組研究對象血清β-HCG、P、E2 水平比較（）

注：治療組予達芙通聯合益腎安宮Ⅱ號口服；對照組予達芙通口服；正常組不予藥物治療；β-HCG 為β 人絨毛膜促性腺激素；P 為孕酮；E2 為雌二醇；與同組治療前比較，aP＜0.05；與對照組治療后比較，bP＜0.05

3.3 三組研究對象血清sTim-3、Gal-9 水平比較治療前，治療組與對照組sTim-3 水平無差異（P＞0.05），均明顯高于正常組（P＜0.05）；治療組與對照組Gal-9 水平無差異（P＞0.05），均明顯低于正常組（P＜0.05）。治療后，治療組與對照組sTim-3 水平均較治療前明顯下降（P＜0.05），且治療組明顯低于對照組（P＜0.05）；治療組與對照組Gal-9 水平均較治療前明顯上升（P＜0.05），且治療組明顯高于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 三組研究對象血清sTim-3、Gal-9 水平比較（pg/mL，）

表3 三組研究對象血清sTim-3、Gal-9 水平比較（pg/mL，）

注：治療組予達芙通聯合益腎安宮Ⅱ號口服；對照組予達芙通口服；正常組不予藥物治療；sTim-3 為可溶性T 細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3；Gal-9 為半乳糖凝集素-9；與同組治療前比較，aP＜0.05；與對照組治療后比較，bP＜0.05；與正常組比較，cP＜0.05

3.4 兩組RSA 患者臨床療效比較 治療組總有效率93.33%，明顯高于對照組73.33%（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組復發性流產患者臨床療效比較（例，%）

4 討論

RSA 病因復雜，包括遺傳、解剖、內分泌、感染、凝血及免疫因素，其中免疫因素是目前RSA 研究的熱點問題[5]。妊娠過程類似半同種異體移植，母體免疫系統對胚胎攜帶的父方抗原產生免疫耐受是成功妊娠的關鍵，免疫耐受失衡會導致RSA[9]。研究發現，Th17/Treg 及Th1/Th2 比例失衡導致過度炎癥反應，從而誘發母胎免疫耐受失衡[10]。

RSA 在中醫學中歸屬于“滑胎”“數墮胎”“屢孕屢墮”范疇。主要病機為脾腎兩虛、氣血不足，治療本病當以“補腎健脾、益氣養血”為法。益腎安宮Ⅱ號由壽胎丸合四君子湯化裁而來，方中鹽續斷、桑寄生、杜仲、菟絲子補腎益精，炒白術、炒黨參、茯苓益氣健脾，炒白芍養血斂陰，阿膠珠、熟地養陰補血，甘草調和諸藥。全方共奏健脾補腎、養血益氣、固沖安胎之效。研究結果表明，益腎安宮Ⅱ號可提高RSA 患者保胎治療效果，使RSA 患者外周血中Th17 細胞比例下降，Treg 細胞比例上升，Th17/Treg 失衡現象得以改善，有利于妊娠的維持[11]。本研究中，治療組總體有效率高于對照組（P＜0.05），提示益腎安宮Ⅱ號聯合地屈孕酮片治療RSA 療效明顯優于單純使用地屈孕酮片。

β-HCG 在妊娠早期能維持妊娠黃體持續增長，刺激黃體分泌孕酮，避免著床的胚胎受到排斥，維持妊娠[12]。孕期E2 主要由卵巢及胎盤產生，隨著孕周呈遞增趨勢，其水平可作為早期胚胎發育標志[13]。本研究結果顯示，治療后，治療組血清β-HCG 及E2 水平較治療前顯著上升（P＜0.05），且兩者水平顯著高于對照組（P＜0.05），提示益腎安宮Ⅱ號對RSA 患者血清β-HCG、E2 水平上升有促進作用，可改善子宮及胎盤的血液循環，為胚胎的順利生長提供良好的內環境，使妊娠得以繼續。

Tim-3 結合其配體Gal-9，產生抑制信號，誘導Th1 與Th17 細胞凋亡，負調節Th1 與Th17 細胞免疫應答[14]。外周血和母胎界面淋巴細胞中Tim-3 表達上調，可抑制免疫反應向Th1 偏移，維持體內Th1/Th2 平衡，有益于成功妊娠[15]。Tim-3 抑制Th17 細胞分化，促進Treg 細胞增殖[16]。上述研究提示，Tim-3-Gal-9 信號通路對維持T 細胞亞群的動態平衡起重要作用，有助于正常妊娠偏于Th2 與Treg 狀態，維持母胎界面免疫耐受，確保成功妊娠。Tim-3 可通過金屬蛋白酶從免疫細胞表面脫落，形成可sTim-3。相關研究表明，流產組外周血中sTim-3 的表達高于正常組[17-18]。推測其機制可能為Tim-3 在免疫細胞上的脫落，從而導致血清中sTim-3 的高表達。Lee 和Goverman[19]認為，sTim-3 與Tim-3 可競爭性結合其共同配體Gal-9，且sTim-3 的結合力和作用效果要優于Tim-3，可干擾Tim-3 與Gal-9 結合，削弱Tim-3-Gal-9 信號通路傳遞負性抑制信號，從而導致RSA的發生。

本研究結果顯示，治療前治療組與對照組sTim-3 水平無差異（P＞0.05），均明顯高于正常組（P＜0.05）；治療組與對照組Gal-9 水平無差異（P＞0.05），均明顯低于正常組（P＜0.05）。提示RSA 患者血清sTim-3 水平明顯高于正常妊娠者，而Gal-9 水平明顯低于正常妊娠者。治療后治療組與對照組sTim-3水平均較治療前明顯下降（P＜0.05），且治療組明顯低于對照組（P＜0.05）；治療組與對照組Gal-9 水平均較治療前明顯上升（P＜0.05），且治療組明顯高于對照組（P＜0.05）。表明經益腎安宮Ⅱ號干預后，RSA 患者血清sTim-3 水平下降，Gal-9 水平上升，減少sTim-3 競爭性結合Gal-9，解除sTim-3 對Tim-3-Gal-9 信號通路的干擾，調節和恢復Tim-3-Gal-9 信號通路介導的母胎免疫平衡，降低流產風險，有益于妊娠結局，值得臨床進一步推廣應用。