不同部位載藥可溶性微針載藥量比較及體外評價

鐘家浩 姚文棟 謝先澤 徐恒武

可溶性微針（dissolving microneedle，DMN）是一種由可溶性生物相容性材料制成微米級針體，在穿透皮膚角質層（stratum corneum，SC）后溶解釋放裝封于針體內藥物的一種新型給藥劑型[1-3]。DMN 刺穿角質層產生微孔道，但其深度不會損傷真皮中的神經末梢和血管[3]。因此，DMN 透皮給藥不會導致出血和疼痛，是一種無痛給藥方式。盡管在藥物遞送方面極具開發潛力，但DMN 由于依賴針體透皮給藥，其載藥局限于針體而使載藥量低，限制了其進一步開發及臨床應用潛力[4]。課題組前期研究中發現，醫用膠布輔助微針給藥后背襯層也會溶解吸收[5-6]。因此，本研究以聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）為材料，制備不同部位載不透皮的多肽類藥物——神經毒素（neurotoxin，NT）的DMN，并對其形態特征，機械強度，載藥量及體外透皮釋放進行評價。

1 材料與方法

1.1 儀 器 微針模具，臺州薇凱生物科技有限公司；HF-50 數顯推拉力計HLX-S 推拉力計測試機架，美國PACK 公司；TL6R 立式低速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；DZF-6050 真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；Waters Alliance e2695型高效液相色譜儀，美國Waters 公司；Nikon Eclipse Ci-L 顯微鏡，日本尼康株式會社。

1.2 材 料 NT，質量分數＞97%，云南龍鳳谷生物藥業有限公司，批號H45 021228；PVP，美國Sigma-Aldrich 公司，批號BCBP9635V；CS，上海麥克林生化科技有限公司，批號C11 082605；實驗用水為去離子水，其他試劑均為分析純。

1.3 不同部位載藥DMN 的制備 本研究依據前期研究使用兩步離心法[5-6]制備DMN（見圖1）：（1）DMN針體的制備：以質量比為1∶1 分別稱取CS 與PVP 于燒杯中，加入5 mg/mL 的NT 水溶液或純水0.8 mL，充分溶解并攪拌均勻。將含藥的基質液注入微針模具中，在4 ℃條件下，4 000 r/min 離心10 min，除去并收集微針模具表面的含藥基質液，放入干燥箱中干燥1 h 后取出備用；（2）DMN 背襯層的制備：以質量比為1∶1 分別稱取CS 與PVP 于燒杯中，加入5 mg/mL的NT 水溶液或純水5.0 mL，攪拌均勻后注入微針模具，相同條件下離心10 min，取出具有含藥基質液的微針模具干燥成形，用彎鑷小心脫模，即得DMN。

圖1 兩步離心法制備不同部位載藥可溶性微針示意圖

1.3.1 針體載藥可溶性微針的制備（DMN-A）在“1.3”項下，（1）中使用5 mg/mL 的NT 水溶液溶解CS與PVP；（2）中加入純水，其余步驟不變，得到針體載藥可溶性微針（DMN-A）的制備。

1.6 體外透皮釋放 使用Franz 擴散池法做體外透皮釋放評價。在Franz 擴散池的接收室內加入pH=7.4 的PBS 作為接收液，超聲排出多余空氣。取離體大鼠皮膚，角質層朝上。將DMN-A、DMN-B、DMN-C置于離體大鼠皮膚上，按壓后用醫用膠布固定，過程中保證皮膚完整性。固定供給池和接收室，隨后以600 r/min 的轉速模擬人體皮下血液和組織液內循環，保持32 ℃恒溫。分別于0、10、20、30 min 及1、2、3、4、6、8 h 后收集0.5 mL 接收液作為樣品進行含量測定，取樣后及時補充等量新鮮接收液。將取出的接收液樣品處理并HPLC 測定濃度，計算并繪制藥物累積滲透釋藥曲線。

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1.7 統計學方法 應用IBM SPSS Statistics 26 軟件進行數據分析。所有數據經Shapiro-Wilk 檢驗（適用于n＜50），均符合正態分布，以均數±標準差（）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。n 表示實驗重復次數。

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1.3.2 背襯層載藥可溶性微針（DMN-B）的制備 在“1.3”項下，（1）中使用純水溶解CS 與PVP；（2）中加入5 mg/mL 的NT 水溶液，其余步驟不變，得到DMN-B 的制備。

1.3.3 針體與背襯層均載藥可溶性微針（DMN-C）的制備 在“1.3”項下，（1）中使用5 mg/mL 的NT 水溶液溶解CS 與PVP；（2）中加入5 mg/mL 的NT 水溶液，其余步驟不變，得到DMN-C 的制備。

1.5 載藥量測定 將DMN 溶于1 mL 去離子水中，提取10 min 后，以8 000 r/min 離心，5 min 后取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，以前期研究中的色譜條件測定其載藥量。

1.4 形態特征及機械強度 將微針裁剪至合適大小置于Nikon Eclipse Ci-L 顯微鏡下觀察形態特征，記錄微針長度及寬度。使用HF-50 數顯推拉力計測定微針縱向與橫向的斷裂力以確定DMN-A、DMN-B、DMN-C 的機械強度。

2 結果

2.2 載藥量測定 針體載藥的DMN-A 載藥量最少，為（15.2±0.3）μg；背襯層載藥的DMN-B 載藥量較DMN-A 顯著升高（P＜0.01），達（87.4±2.8）μg；針體與背襯層均載藥的DMN-C 載藥量較DMN-A 也顯著升高（P＜0.01），為（103.7±3.2）μg；表明背襯層載藥空間的增加使載藥量明顯提升。

表1 不同部位載藥的DMN 機械強度

圖2 不同部位載藥可溶性微針1 h 與8 h 透皮釋放曲線（n=3）注：DMN-A 是針體載藥可溶性微針；DMN-B 為背襯層載藥可溶性微針；DMN-C 為針體與背襯層均載藥可溶性微針

圖2 DMN 正置與側置下形態特征（比例尺為1000 μm）

2.1 形態特征及機械強度 三種DMN 均由同一批微針模具制備，形態特征一致。如圖2 所示，DMN 整體為金字塔形，正置鏡頭下可見正方形及棱邊輪廓，側置鏡頭下為三角形。DMN 高度達500 μm，底寬度為300 μm，針體之間間距約為850～900 μm。機械強度如表1 所示，DMN-A、DMN-B、DMN-C 的橫向斷裂力、縱向斷裂力比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 體外透皮釋放 體外透皮釋放如圖3 所示，三種不同的DMN 的釋放均呈現緩釋狀態，但又有明顯的差異。針體載藥的DMN-A 在三者中釋放速度最快，盡管在前期釋放較慢（前20 min），但在1 h 已大于60%，且在4 h 已釋放90%以上；背襯層載藥的DMN-B 在三者中釋放速度最緩，0.5 h 仍不足10%，8 h 未達60%，DMN-B 在8 h 仍呈釋放趨勢；針體與背襯層均載藥的DMN-C 釋放速度略快于DMN-B，但明顯低于DMN-A，8 h 釋放70%，在4～8 h 釋放速度已有所減緩，但仍呈釋放趨勢。

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3 討論

DNM 通過微米級針體穿透角質層，與體液接觸后生物相容性材料溶解釋放裝封在微針中的藥物[1-3]。前期研究發現，背襯材料溶解后亦會通過皮膚吸收。因此，本研究制備了不同部位載藥的DMN-A、DMNB、DMN-C 并對其進行表征及體外評價。三種不同部位載藥的DMN 形態特征一致，均為金字塔形，表明載藥對形態無影響。DMN 通過針體穿過SC 釋藥，需要具備足夠的機械強度。前期研究中發現PVP 及CS的復合材料可以增強機械強度，因此選擇了兩者機械強度比例制備DMN[5]。已有研究表明，金字塔形的微針相比于其他形狀微針結構更為穩固[7]，能夠更好地穿透SC。所制備的三種微針在機械強度無明顯差異，不同部位載藥未改變機械強度。

進一步，通過對2017年不同讀者實際參與采訪工作的程度進行初步分析，得到如圖1所示的結果。由圖可知，研究生讀者對采訪工作的參與程度與借閱需求極度不對稱（薦購書目冊次與借閱冊次比值小于0.05）；由于我館采訪模式的設置，教職工對采訪工作的參與程度較高；本專科生與全英語實驗班的參與程度處于較低水平。

在制備的三種DMN 中DMN-A 的載藥量最低，這是因為其只通過微針針體載藥，相比于其余兩者載藥空間最小。盡管載藥量較低，在釋放時由于針體最先穿過角質層與體液接觸，因此，DMN-A 釋放速率遠高于其余兩者，在4 h 已基本釋放完全。背襯層載藥明顯增加了載藥空間，DMN-B 載藥量約為DMN-A 的5.75 倍。但DMN-B 釋放速率最慢，在最初30 min 釋放極少，較DMN-A 呈現更明顯的緩釋趨勢[8]。這是由于，DMN-B 需要先溶解進入皮膚的前端針體，然后再釋放。由于針體與背襯層均載藥，載藥空間最大，DMN-C 載藥量最高，約為DMN-A 的6.82 倍。在體外透皮釋放時，DMN-C 針體溶解后在前期較DMN-B 也有明顯釋放，背襯層的緩慢釋放也較DMN-A 持久。盡管DMN-C 兼具DMN-A 兩者特性，但其在6 h 后仍有釋放，甚至8 h 依舊未釋放完全。而微針在穿透活體動物的角質層后，微孔道在6 h 基本恢復，8 h 恢復完全[8-9]。DMN-B、DMN-C 有部分在背襯層中的藥物滯留在角質層外。因此，DMN-C相較DMN-A 雖顯著提高了載藥量，仍存在優化空間。后續可改進針體及靠近微針的前部背襯層用于載藥，而靠后的背襯層部分不載藥，調整其比例，使DMN-C 在6 h 內釋放完全。