動脈粥樣硬化不穩定斑塊的小鼠動物模型建立與評價

王壹民 劉 強

動脈粥樣硬化是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的病理基礎，以不穩定斑塊破裂或侵蝕導致的血栓栓塞事件是引起急性冠脈綜合征（ACS）的主要原因[1]。不穩定斑塊包含以大壞死核心為特征的薄纖維帽粥樣硬化斑塊（TCFA）和侵蝕引起的糜爛斑塊[2-3]。目前國內外關于不穩定斑塊動物模型的研究報道較少，一般采用高脂飲食喂養誘導斑塊形成，但該類模型很少自發斑塊破裂或侵蝕，不能很好地模擬人類動脈粥樣硬化斑塊病變進程[4]。為系統研究不穩定斑塊的病理生理特征及觀察藥物的干預效應，有必要建立一個可重復性高，貼近臨床的不穩定斑塊動物模型。

1 實驗動物的選擇

目前許多動物模型已經成熟地應用到動脈粥樣硬化領域中。小鼠因其繁殖迅速、易于遺傳操作以及能夠在合理時間范圍內監測動脈粥樣硬化發生等特性，已成為研究動脈粥樣硬化的主要物種[5]。經統計超過95%的動脈粥樣硬化研究基于載脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠或低密度脂蛋白受體基因敲除（LDLR-/-）小鼠，其中ApoE-/-小鼠應用最為廣泛，約占研究總數的68.6%[6]。與LDLR-/-小鼠相比，ApoE-/-小鼠能更快地形成斑塊，并且具有更復雜多樣的表型[7]。因此，以ApoE-/-小鼠為基礎進行基因操作或外科干預來構建不穩定斑塊模型的研究越來越多，本文回顧了近年常用的ApoE-/-小鼠不穩定斑塊模型的造模方法、模型特點（見表1），為不穩定斑塊模型小鼠的研究提供科學依據。

表1 常見不穩定斑塊動物模型特點

2 實驗動物的造模方法

2.1 右頸總動脈串聯狹窄模型（TS 模型）TS 模型為ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養6 周后，部分結扎距離右頸總動脈起始部1 mm 和4 mm 處血管，形成兩處直徑為150 μm 的串聯狹窄[8]。術后7 周在0～1 mm 處可觀察到典型薄纖維帽粥樣硬化斑塊特征，在4 mm遠端則表現出穩定斑塊特征。計算流體動力學（CFD）顯示TS 模型顯著降低了右側頸動脈血流量（65%），由此在0～1 mm 處形成了較低壁面剪切應力和較高拉伸應力的局部環境。通過對比頸動脈狹窄前后的斑塊組成成分，研究者發現在TS 模型中不穩定斑塊比穩定斑塊擁有更高比例的巨噬細胞、白細胞，更大面積的脂質核心，并且可以自發斑塊內血管新生和斑塊破裂，腔內血栓形成[9]。TS 模型可提供同一只小鼠不同斑塊類型的組織樣本，從而可以直接比較穩定/不穩定斑塊間的特征，以此探索不穩定動脈粥樣硬化的潛在治療和診斷靶點，但不適用于斑塊鈣化及斑塊侵蝕方面的研究。

2.2 主動脈縮窄模型（TAC 模型）TAC 模型是一種通過外科手術建立的頭臂干和左頸總動脈之間的主動脈狹窄構建的壓力負荷誘導的射血分數降低性心衰小鼠模型[10]。Marino 等[11]對普通飼料喂養的ApoE-/-小鼠進行主動脈縮窄術，引起近端主動脈收縮壓、平均動脈壓增高，術后8～25 周進行跑步機試驗，同時監測心功能及心電圖表現。實驗期間約有83%的小鼠死亡，心臟組織學分析顯示其中74%存在心梗證據，包括TCFA 破裂和斑塊侵蝕引起的血栓栓塞，以及運動相關的急性冠狀動脈閉塞，后者表現為嚴重的心肌纖維化。該模型通過高脂血癥及高血壓雙危險因子誘導小鼠冠狀動脈不穩定斑塊形成，與其他動脈粥樣硬化模型相比，研究者直接觀察小鼠冠脈病變，并系統研究心臟相關終點事件，這更加符合人類冠心病的病變部位及心梗事件發生原因。適用于評估冠狀動脈病變形成和進展的生物學研究。但該模型要求研究人員具備一定的手術操作技能和手術后監測護理動物的經驗。

2.3 左腎動脈和左頸總動脈部分結扎模型（R+C 模型）部分結扎ApoE-/-小鼠左腎動脈及左頸總動脈，造成腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）持續激活和左頸總動脈局部低振蕩剪切應力環境，術后正常飼養8 周，即觀察到小鼠左頸總動脈不穩定斑塊表型，80%的小鼠自發斑塊內出血和斑塊破裂[12]。與之相比，頸動脈部分結扎組小鼠的斑塊內出血和斑塊破裂發生率僅為10%，而腎動脈部分結扎組小鼠未觀察到不穩定斑塊表型。用氯沙坦治療R+C 模型小鼠后，可拮抗由RAAS 系統激活導致的血壓升高，并顯著降低斑塊內出血、破裂發生率，由此證實內源性血管緊張素Ⅱ作為低剪切應力下頸動脈斑塊進展誘導因子的作用。R+C 模型模擬內源性腎血管性高血壓及局部切應力變化導致的不穩定斑塊形成，但該模型未檢測斑塊內新生血管形成，對斑塊內出血的具體機制未作闡述。

2.4 左頸總動脈電損傷及狹窄模型（Two Hit 模型）Franck 等[13]對正常飲食喂養的ApoE-/-小鼠左頸總動脈施加電流脈沖，術后4 周在損傷近端放置錐形套管，造成電損傷處低振蕩剪切應力環境，這種先后兩次對同一動脈段的損傷被稱為“Two Hit”。研究者發現，電損傷導致內皮細胞慢性激活及修復能力受損，并誘導富含平滑肌細胞和透明質酸的內膜增生，這種纖維內膜幾乎沒有巨噬細胞和脂質核心，符合人類斑塊侵蝕的相關特征。放置套管后造成的血流紊亂環境促進電損傷段管腔內皮細胞脫落，Ly6G+中性粒細胞浸潤及血小板活化，最終導致腔內血栓形成。該模型通過纖維內膜增生及血流紊亂環境引起斑塊侵蝕，是研究動脈粥樣硬化斑塊侵蝕表型的全新方法。

2.5 ApoE-/-Fbn1C1039G+/-模型 原纖維蛋白-1（Fibrillin-1，Fbn1）基因的突變會導致馬凡氏綜合征，這是一種以彈性纖維進行性斷裂為特征的遺傳性疾病。Van 等[14]利用雜交技術獲得具有原纖維蛋白-1基因雜合點突變的載脂蛋白E 敲除小鼠。西方飲食喂養35 周，和ApoE-/-小鼠相比，ApoE-/-Fbn1C1039G+/-小鼠從第5 周開始出現左室功能障礙，表現為舒張末期內徑（EDD）、收縮末期內徑（ESD）和心臟重量顯著增加。實驗期間有70%的小鼠猝死，對所有小鼠心臟進行組織學分析顯示，96%存在冠狀動脈不穩定斑塊和心肌梗死證據。ApoE-/-Fbn1C1039G+/-模型避免了機械損傷，但制備該基因修飾小鼠可能需要一定的時間和經濟成本，同時猝死的高發生率可能會對研究造成限制。此外，60%以上的ApoE-/-Fbn1C1039G+/-小鼠表現出定向障礙、運動障礙等神經系統癥狀，TTC染色顯示存在腦缺血損傷，提示中風可能是小鼠的死亡原因之一，這些非心血管相關并發癥增加了實驗的復雜性和潛在的混雜因素。

3 動物模型的評價方法

3.1 斑塊成分分析 對斑塊內部各組分的分析可以了解斑塊的性質。Shiomi 等[15]提出，斑塊易損指數=脂質成分（巨噬細胞+細胞外脂質）/肌纖維成分（平滑肌細胞+膠原纖維），適用于整體上評價TCFA 的不穩定性，但不適用于糜爛斑塊。安園園等[16]對該公式進行改良，即斑塊易損指數=斑塊易損成分/纖維帽完整性，可以對兩類不穩定斑塊進行評價。此外，炎癥及免疫細胞在斑塊內的分布也備受關注。Guo 等[17]發現，CD163+巨噬細胞通過血管內皮生長因子介導的斑塊內微血管生成促進斑塊內出血。Leistner 等[18]利用流式細胞術對糜爛斑塊進行分析后發現斑塊內部CD4+和CD8+T 淋巴細胞選擇性富集。

3.2 炎癥指標 不穩定斑塊的炎癥相關生物標志物主要有白細胞介素-1（IL-1）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）等。IL-1 是一種被廣泛研究的炎性細胞因子，參與其他促炎細胞因子的產生和血管壁內炎性細胞（如巨噬細胞）的募集等。CANTOS 試驗已證實在標準治療的基礎上，應用卡納單抗（canakinumab）抑制IL-1β 能顯著降低心肌梗死患者的心血管事件復發率[19]。MCP-1 具有動員單核細胞至斑塊內的作用，Georgakis 等[20]在1199 例因頸動脈狹窄接受動脈內膜切除術的患者中發現，斑塊MCP-1 水平與不穩定斑塊的組織病理學特征和分子標記物相關，其中，既往有急性腦血管事件的患者斑塊MCP-1 水平顯著高于無癥狀斑塊患者。Zhao 等[21]使用無水乙醇灌洗右側頸總動脈段聯合西式飲食建立不穩定斑塊模型后發現，血清MCP-1 水平與斑塊易損性相關。MMP-9 過度表達可促進胞外基質降解，促進斑塊不穩定性。Seifert 等[22]對ApoE-/-小鼠右頸動脈植入錐形套管改變其周圍血流動力學，通過套管上游管腔低剪切應力環境誘導不穩定斑塊形成，相比之下套管下游病變呈現出穩定斑塊特征，研究者發現在該模型中不穩定斑塊的MMP-9 表達量顯著高于穩定斑塊。

3.3 斑塊侵蝕、斑塊破裂和腔內血栓形成 獲得病理切片后，對平滑肌細胞或Ⅰ型膠原進行免疫學染色以定位纖維帽，判斷纖維帽的連續性及厚度。血栓表面標志物（如CD41）及纖維帽的雙染則可在證實存在血栓的基礎上觀察血栓是否從管腔延伸到破裂斑塊內部[11]。若連續切片染色顯示血栓位于管腔，鄰近斑塊但不在斑塊內，且血栓附著斑塊處內皮細胞核覆蓋缺失，或見纖維帽增厚，則可排除斑塊破裂，考慮是由斑塊侵蝕觸發腔內血栓形成。此外，連續切片的內皮和平滑肌細胞染色有助于證實破裂斑塊脫落。目前對不穩定斑塊的解釋多為TCFA，最終導致斑塊破裂及血栓形成。而表面侵蝕的斑塊病理特征與TCFA 不同，該類斑塊缺乏脂質及巨噬細胞浸潤，富含平滑肌細胞及Ⅲ型膠原，以內皮細胞激活為起點，斑塊侵蝕逐漸導致中性粒細胞聚集，內皮細胞死亡、脫落及壁血栓形成[23]。Franck 等[13]對ApoE-/-小鼠左頸總動脈進行電刺激造成內膜損傷，4 周后在損傷近端動脈放置袖帶，造成損傷處血流紊亂及振蕩壁面剪切應力，模擬人斑塊侵蝕等相關病理過程。

3.4 斑塊內新生血管和斑塊內出血 斑塊內局部缺氧及炎癥微環境會誘導外膜血管滋養管進入內膜，形成斑塊內新生血管[24]。在定量計算時通過CD31 免疫學染色得出斑塊內新生血管數量。CD31 和α-SMA 的雙染則可評估新生血管的成熟度，成熟血管表現為完全由平滑肌細胞覆蓋的單層內皮細胞，而未成熟血管僅呈現內皮細胞層。對血小板的染色可以測定斑塊內出血的程度。此外，在設計藥物對斑塊內新生血管的影響實驗中，研究者有時會加用基質膠塞實驗（Matrigel plug assay）以直接評估藥物對血管新生的作用[25]。

4 討論

在脂質譜和脂蛋白代謝方面，小鼠的主要循環血脂是高密度脂蛋白（HDL），其血漿膽固醇的運輸主要通過HDL 來完成。ApoE 是清除乳糜微粒和極低密度脂蛋白（VLDL）受體的配體，該基因的敲除導致血漿膽固醇以VLDL 的形式升高，而不是LDL。此外，ApoE 還參與合成細胞（主要是骨髓來源的巨噬細胞/單核細胞系）的其他生物學功能[5，26]。在病變分布方面，小鼠動脈粥樣硬化好發于主動脈根部和頭臂動脈、左頸動脈、鎖骨下動脈的分支點，這些病變部位并不是導致人類心血管疾病的主要區域，由于組織收集大小的限制，小鼠的冠脈病變并不容易被觀察到。盡管存在這些差異，轉基因小鼠對于我們理解動脈粥樣硬化的分子機制和潛在治療途徑仍是非常寶貴的[27]。

目前由TCFA 破裂導致ACS 的概念已得到廣泛接受，隨著他汀類藥物的普及，TCFA 可轉變為更穩定的形態特征，作為ACS 的另一種機制，纖維帽完整的糜爛斑塊導致的急性冠狀動脈綜合征（IFC-ACS）逐漸引起關注。該類病變涉及內皮完整性的破壞，在內皮剝脫區域易形成血栓，而不破壞覆蓋在斑塊表面的纖維帽[28]。Leistner 等[18]通過光學相干斷層掃描（OCT）對170 例ACS 患者的冠脈罪犯病變分析發現，IFC-ACS 約占ACS 的三分之一，但其潛在的病理生理機制仍不明確。當前所建立的臨床前動物實驗病變所多為TCFA，尚無被廣泛接受的模擬人類斑塊侵蝕的動物模型，需要進一步探索和研究。