犬瘟熱病毒實時熒光定量PCR 檢測方法的建立

郝良玉，郭衍冰，劉沂霖，尚麗元，馮 凱，浩佳藝，李昱潔，王改麗

吉林省畜牧獸醫科學研究院，吉林長春 130062

犬瘟熱是犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種急性、高度接觸性、嚴重發熱性傳染病。CDV 為副黏病毒科麻疹病毒屬成員，有多種細胞趨向性，導致全身感染。病毒粒子呈高度多形性，直徑約150 nm，通常為橢圓形或球形、不分節段的單股負鏈RNA(ssRNA)。CDV 基因組包含15 690 個核苷酸，由6個獨立且非重疊轉錄單位(N-P-M-F-H-L)構成基因組結構，N 基因是核衣殼的主要組成部分，具有較強保守性，不僅與病毒的轉錄調控和復制相關，而且在病毒逃避宿主先天免疫應答中發揮重要作用。

1 材料

1.1 細胞、毒株及樣品

MDCK 細胞、犬瘟熱病毒疫苗株CDV3由中國農科院特產研究所特種動物病原與免疫實驗室保存，犬細小病毒（CPV）滅活疫苗株由本實驗室保存，犬冠狀病毒（CCV）由本實驗室分離鑒定并保存。

1.2 主要試劑

Premix Taq 酶、反轉錄試劑均購自Takara 公司；病毒核酸提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購于天根公司；SYBR GreenI 染料購自Roche 公司。

2 方法

2.1 設計引物

參考CDV3N 基因序列（GenBank 登錄號：EU7 26268.1）的保守區域設計特異性引物，P1：5'-T GAGCCACGCCACGACA-3'，P2：5'-TCCCAGGTTGACTGAG CATCT-3'，目的基因擴增片段長度為116 bp。

2.2 擴增N 基因

取低溫保存的CDV3病毒液，參照病毒RNA 提取試劑盒說明書提取病毒RNA，隨即將其反轉錄成cDNA。PCR 擴增試驗以cDNA 為模板，待反應完成后向2%的瓊脂糖凝膠加入擴增產物5 μL，用于電泳檢測。PCR 擴增條件及反應體系如表1 所示。

表1 PCR 擴增條件及反應體系

2.3 制備標準品

回收、純化擴增產物連接pMD18-T 載體，并轉化至感受態細胞，接種在含氨芐抗性的固體培養基倒置培養過夜，取單菌落接種于含氨芐抗性的液體培養基培養，PCR 鑒定質粒后送往生工測序。利用Qubit3 熒光定量儀測定質粒濃度，并按拷貝數＝[6.02×1023×濃度(ng/μL)×10-9]/(質粒長度×660)計算拷貝數。

2.4 優化反應條件及標準曲線的建立

陽性標準品經梯度稀釋后作為模板，采用單變量法依次優化引物濃度、退火溫度、復性時間等，按照SYBR GreenI 說明書配制實時熒光定量PCR 擴增體系，總體系為20 μL，多次重復以確定最佳反應條件并繪制標準曲線。

2.5 靈敏度試驗

以倍比稀釋的標準質粒為模板進行擴增，陰性對照選用無菌去離子水代替模板，以Ct 值＜35 且出現標準“S”型擴增曲線的濃度作為本方法的最低檢測限度。

2.6 重復性試驗

不同稀釋度分別設置3 個樣品進行熒光定量PCR 重復性試驗，通過變異系數(CV)=標準偏差（SD）/平均數，計算組內和組間各Ct 值的變異系數。

2.7 特異性試驗

用病毒RNA 提取試劑盒提取CCV 基因組RNA，隨即反轉錄合成cDNA；用病毒DNA 試劑盒提取CPV基因組DNA。應用優化SYBR GreenI 熒光定量PCR方法進行擴增，設置陰性對照，驗證并比較其特異性。

3 結果與分析

3.1 CDV3 N 基因PCR 擴增結果

提取CDV3基因組，反轉錄成cDNA 后，利用針對N 基因所設計的特異性引物進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳進行擴增產物檢測，得到與目的片段116 bp 大小一致的擴增片段。

3.2 實時熒光定量PCR 反應體系及條件的優化

優化后擴增總體系20 μL，其中SYBR 酶10 μL，上、下游引物各1 μL，質粒模板1 μL，無菌去離子水7 μL，最終反應程序：預變性95 ℃ 5 min；熒光檢測95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，運行40 個循環。該反應體系可獲得良好擴增曲線，PCR 產物呈單條帶。

3.3 標準質粒濃度測定及拷貝數計算

使用Qubit3 熒光定量儀測定標準質粒濃度為35.2 ng/μL，經公式計算得到標準質粒的拷貝數為2.77×1012拷貝/μL。

3.4 標準曲線的建立

分 別 以2.77×101～2.77×107拷 貝/μL 的標準質粒進行實時熒光定量PCR，循環數（y）與標準質粒拷貝數的對數（lgC）關系式為y=2.4857X+15.524，擴增相關系數R2=0.9865。結果表明，本方法建立的標準曲線線性關系良好，各稀釋度間相關性強，誤差較小，可準確反應目的基因的擴增。實時熒光定量PCR 熔解曲線結果為單峰型曲線，擴增產物在77 ℃出現單一波峰，無引物二聚體和非特異擴增峰。

3.5 靈敏度試驗

倍比稀釋標準質粒濃度后進行試驗，結果顯示當標準質粒拷貝數為2.77 拷貝/μL 時，才有擴增曲線出現，而2.77×10-1拷貝/μL 無擴增曲線，故本方法最低檢出限度為2.77 個拷貝。

3.6 重復性試驗

以不同稀釋度標準質粒為模板分別進行組內和組間重復試驗。結果見表2，組內Ct 值變異系數為0.77% ～1.31%，組間Ct 值變異系數為0.89%～1.21%，表明本方法復現性強。

表2 CDV3 實時熒光定量PCR 重復性結果

3.7 特異性試驗

本方法檢測犬細小病毒DNA 及犬冠狀病毒cDNA均無熒光信號，表明方法特異性良好，對犬細小病毒及犬冠狀病毒均無特異性擴增，不會產生交叉反應。

4 討論與結論

犬瘟熱呈世界性分布，發病率及死亡率很高，臨床以雙相熱、胃腸炎、急性呼吸系統炎癥和神經癥狀為主。其病毒宿主范圍不斷擴大，對各地的野生動物和瀕危物種保護構成威脅。CDV、CPV 和CCV都可引起嚴重腹瀉，特點是傳染性極強、感染后發病速度快、死亡率高。受感染犬從患病初期無癥狀到亞臨床、急性發病期的感染癥狀十分相似，難以鑒別診斷。因此，建立快速準確鑒定這些病毒的新型診斷方法一直是研究的熱點與難點。

檢測犬瘟熱病毒主要有免疫學檢測技術[1]、分子生物學檢測技術[2]及基因芯片檢測技術等方法。在PCR 反應體系中加入指示DNA 片段擴增過程的熒光染料或熒光標記的特異性探針，實時監測熒光信號的積累，通過檢測病毒核酸達到檢測目的，即為實時熒光定量PCR 方法。與探針法相比，染料法簡便且成本更低，單PCR 產物可與多分子染料相結合，因此SYBR GreenI 染料法靈敏度高，信噪比高，樣品熒光信號強。檢測結束后通過熔解曲線分析產物，進行擴增產物和引物二聚體的識別，以區分是否存在非特異擴增，保證檢測結果更加準確。

本試驗針對CDV3N 基因的保守序列片段設計了特異引物，經單變量法優化條件建立SYBR GreenI熒光定量PCR 方法，該方法特異性強，與CPV、CCV 常見犬腸道病毒無交叉反應。本方法最低檢測限為2.77 拷貝/μL，優于傳統PCR 方法；組內及組間重復性試驗Ct 值的變異系數均低于1.21%，表明本方法重復性良好，在臨床診斷中具有可行性，能夠應用于犬瘟熱病毒檢測及分子流行病學調查。