TGF?β1調控人肺泡上皮細胞中DNA甲基化酶和端粒酶的機制

孫梓越，錢力，李丹，朱瑞芳，韓永康，劉學軍*

·科研論著·

TGF?β1調控人肺泡上皮細胞中DNA甲基化酶和端粒酶的機制

孫梓越1，錢力2，李丹2，朱瑞芳2，韓永康1，劉學軍2*

1.山西醫科大學，山西 030001；2.山西醫科大學第一醫院

通過轉化生長因子?β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1）誘導的人肺泡上皮細胞A549觀察脫氧核糖核酸（DNA）甲基化酶和端粒酶的變化。采用TGF?β1誘導A549細胞建立體外肺纖維化模型，分為對照組、TGF?β12 μmol/L干預組、TGF?β15 μmol/L干預組和TGF?β110 μmol/L干預組。采用β?gal染色法檢測細胞衰老程度；酶聯免疫吸附測定（ELISA）法和逆轉錄熒光定量聚合酶鏈式反應（RT?qPCR）檢測炎癥因子白細胞介素?1β、白細胞介素?6表達變化；RT?qPCR檢測I型膠原蛋白（COL?I）、纖維連接蛋白1（FN1）、張力蛋白C（Tensin?C）、DNA甲基轉移酶（DNM）T3a、DNMT3b、鈣黏蛋白（CDH1）及端粒酶逆轉錄酶信使核糖核酸（mRNA）的表達；蛋白質免疫印跡法（Western Blot）檢測端粒酶逆轉錄酶蛋白表達。對照組幾乎未見衰老細胞，干預組細胞衰老程度隨TGF?β1濃度升高而增加；TGF?β1干預組白細胞介素?1β、白細胞介素?6含量明顯升高（<0.05）；對照組A549細胞形態呈典型的上皮細胞樣形態，TGF?β1干預組出現典型的間質細胞樣形態，Masson染色結果顯示對照組細胞幾乎未見藍色膠原蛋白，而TGF?β1干預組藍染膠原蛋白表達明顯增多，發生纖維化改變；TGF?β1干預組與對照組比較，COL?I、FN1、Tensin?C、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達明顯升高（<0.05），端粒酶逆轉錄酶和CDH1基因mRNA的表達降低（<0.05），Western Blot進一步驗證端粒酶逆轉錄酶蛋白表達降低（<0.05）。TGF?β1導致A549細胞發生衰老，并促進炎癥因子和致纖維化因子高表達發生纖維化改變；TGF?β1促進了DNA甲基化酶的表達，抑制了端粒酶逆轉錄酶的表達。

特發性肺纖維化；轉化生長因子?β1；A549細胞；脫氧核糖核酸甲基化；端粒酶逆轉錄酶

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種與衰老相關的慢性進展性間質性肺疾病[1]，好發于老年男性，確診后中位生存期為3～5年[2]。特發性肺纖維化發病機制尚不明確，缺乏有效的治療手段。近年來,隨著藥食同源理論的快速發展，關于食療在治療慢性病方面的研究日益成為熱點，多種研究發現槲皮素(quercetin，QUE)可以抑制轉化生長因子?β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1)誘導的A549細胞進行間質轉化，減輕肺纖維化小鼠的炎癥反應[3?6]。此外，有研究發現，中醫藥通過作用于脫氧核糖核酸（DNA）甲基化、miRNA表達調控和組蛋白修飾等方面在特發性肺纖維化形成和發展中發揮關鍵作用[7]，但具體機制尚未得到充分研究。已有研究證實，特發性肺纖維化的發生與端粒變短、端粒酶活性改變、DNA甲基化等表觀遺傳改變相關，而TGF?β1作為致纖維化因子在特發性肺纖維化形成中發揮重要作用。端粒酶逆轉錄酶（TERT）和DNA甲基轉移酶（DNM）T3a、DNMT3b分別被認為是端粒酶活性及DNA甲基化的關鍵因子，反映端粒酶活性及DNA甲基化水平。前期實驗證實了DNMT3a、DNMT3b、端粒酶逆轉錄酶表達變化在肺纖維化小鼠中與年齡因素相關[8?9]。本實驗通過TGF?β1誘導A549細胞發生上皮間質轉化（EMT）構建體外肺纖維化模型，分析A549細胞纖維化表型改變及端粒酶逆轉錄酶、DNMT3a、DNMT3b表達變化，以闡明TGF?β1與端粒酶活性及DNA甲基化的作用關系，旨在探討TGF?β1與端粒酶活性和DNA甲基轉移酶的關系，闡述其在肺纖維化發病機制中的作用，同時也為藥食同源理論治療肺纖維化提供新的思路和方向。

1 材料和方法

1.1主要試劑A549細胞（購于中國科學院上海細胞庫）；DMEM?F12、trypsin/EDTA、RNA提取試劑盒、Trizol試劑盒、白細胞介素?1β酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、白細胞介素?6 ELISA試劑盒（美國 Invitrogen公司）；β?半乳糖苷酶原位染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq試劑盒（北京聚合美）；Masson染色試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、凝膠制備試劑盒、彩色預染蛋白marker（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗端粒酶逆轉錄酶單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體（美國abcam公司）；羊抗兔IgG二抗（美國Sigma公司）；PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2細胞培養將A549細胞復蘇后加入90%高糖培養液（DMEM)?F12+10%胎牛血清蛋白（FBS），在37 ℃、5%二氧化碳（CO2）培養箱中恒溫培養。通過加入TGF?β1干預7 d后建立肺上皮細胞復制性衰老模型分組進行干預。對照組：無血清培養條件下培養24 h；TGF?β1干預組：無血清培養條件下，給予不同濃度TGF?β1（分別為2 μmol/L、5 μmol/L及10 μmol/L）誘導培養24 h，收集細胞備用。

1.3β?gal染色法通過β?gal染色法檢測TGF?β1梯度刺激對A549細胞衰老的影響。取對照組、TGF?β12 μmol/L干預組、TGF?β15 μmol/L干預組及TGF?β110 μmol/L干預組各組細胞進行細胞轉染，轉染細胞24 h后可以使用β?半乳糖苷酶原位染色試劑盒對正常對照組及TGF?β1干預組進行原位染色，將各組細胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察藍綠熒光蛋白的表達情況，計算轉染效率，檢測β?半乳糖苷酶的表達。

1.4ELISA法檢測細胞因子通過ELISA法檢測TGF?β1梯度刺激對A549細胞白細胞介素?1β、白細胞介素?6蛋白表達的影響。收集對照組、TGF?β12 μmol/L干預組、TGF?β15 μmol/L干預組及TGF?β110 μmol/L干預組各組細胞，加入60 μL放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液，在4 ℃裂解30 min。12 000 r/min，4 ℃，離心10 min。BCA法測定蛋白濃度，用RIPA裂解液調整樣本蛋白濃度至5 μg/μL。按照ELISA試劑盒說明書操作，配制標準品，經過加樣、孵育、清洗、顯色、終止等過程，利用酶標儀測量各孔的OD值。

1.5逆轉錄熒光定量聚合酶鏈式反應（Real?time Quantitative PCR，RT?qPCR）利用RT?qPCR檢測TGF?β1對A549細胞白細胞介素?1β、白細胞介素?6、I型膠原蛋白（COL?I）、纖維連接蛋白（FN1）、張力蛋白C（Tensin?C）、DNMT3a、DNMT3b、鈣黏蛋白1（CDH1）及端粒酶逆轉錄酶信使核糖核酸（mRNA）表達的影響。首先檢測TGF?β1梯度刺激對A549細胞白細胞介素?1β、白細胞介素?6 mRNA表達的影響，取對照組、TGF?β12 μmol/L干預組、TGF?β15 μmol/L干預組及TGF?β110 μmol/L干預組各組細胞，用Trizol法提取核糖核酸（RNA），根據反轉錄試劑說明將RNA合成cDNA，采用2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq試劑盒進行RT?qPCR，結果采用相對定量法，以2?△△Ｃt表示基因的相對表達水平。根據實驗結果選取對照組細胞和TGF?β110 μmol/L干預組細胞檢測COL?I、FN1、Tensin?C、DNMT3a、DNMT3b、CDH1及端粒酶逆轉錄酶mRNA表達水平，實驗方法采用RT?qPCR。mRNA引物序列見表1。

表1　引物序列

1.6Masson染色取對照組細胞和TGF?β110 μmol/L干預組細胞，用4%多聚甲醛細胞固定液固定細胞30 min后，PBS清洗3次，每次10 min。按Masson染色試劑盒說明書進行染色，封片，顯微鏡下觀察，藍色為膠原蛋白，通過軟件Image Pro Plus計算。

1.7蛋白質免疫印跡法（Western Blot）檢測端粒酶逆轉錄酶蛋白表達取對照組細胞和TGF?β110 μmol/L干預組細胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，進行電泳、轉膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，隨后加入一抗（GAPDH 1∶5 000，端粒酶逆轉錄酶1∶2 500），4 ℃過夜。次日洗膜3次，加入羊抗兔IgG二抗（1∶8 000），室溫孵育2 h，再次洗膜后采用電化學發光法（ECL）試劑盒顯色。

1.8統計學方法使用SPSS 19.0統計軟件進行分析，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（±）表示，行獨立樣本檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK檢驗，以<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1β?gal染色法檢測TGF?β1誘導A549細胞發生衰老的程度從對照組、TGF?β12 μmol/L干預組、TGF?β15 μmol/L干預組及TGF?β110 μmol/L干預組各組細胞的β?gal染色可以看出，對照組幾乎未出現衰老細胞，而TGF?β1干預組隨著TGF?β1濃度的不斷升高，衰老細胞越多，詳見圖1。各組細胞衰老細胞百分比隨TGF?β1濃度升高而升高，詳見表2。

圖1　β?gal染色圖（A為對照組，B為TGF?β1 2 μmol/L干預組，C為TGF?β1 5 μmol/L干預組，D為TGF?β1 10 μmol/L干預組）

表2　β?gal染色法檢測各組衰老細胞陽性率

① 與對照組比較，<0.05。

2.2ELISA法檢測TGF?β1梯度刺激A549細胞對白細胞介素?1β、白細胞介素?6含量的影響隨著TGF?β1濃度的升高，A549細胞白細胞介素?1β、白細胞介素?6含量也進一步升高，而TGF?β15 μmol/L干預組、TGF?β110 μmol/L干預組與TGF?β12 μmol/L干預組比較，A549細胞白細胞介素?1β、白細胞介素?6含量明顯升高（<0.05），提示TGF?β1促進了A549細胞白細胞介素?1β、白細胞介素?6蛋白的分泌。詳見表3。

表3　各組白細胞介素?1β、白細胞介素?6含量 單位：pg/mL

① 與對照組比較，<0.05；② 與TGF?β12 μmol/L干預組比較，<0.05；③ 與TGF?β15 μmol/L干預組比較，>0.05。

2.3各組細胞因子、DNA甲基轉移酶和端粒酶逆轉錄酶mRNA檢測結果TGF?β1干預組與對照組比較，白細胞介素?1β、白細胞介素?6 mRNA表達明顯升高（<0.05）；TGF?β110 μmol/L干預組COL?I、FN1、Tensin?C mRNA表達明顯升高（<0.05）；TGF?β110 μmol/L干預組DNMT3a和DNMT3b mRNA的表達明顯升高，端粒酶逆轉錄酶和CDH1基因mRNA的表達明顯降低（<0.05），詳見表4～表6。

表4　各組白細胞介素?1β、白細胞介素?6 mRNA表達

① 與對照組比較，<0.05；② 與TGF?β12 μmol/L干預組比較，<0.05；③ 與TGF?β15 μmol/L干預組比較，>0.05。

表5　各組細胞COL?I、FN1、Tensin?C mRNA表達

表6　各組細胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1及端粒酶逆轉錄酶mRNA表達

2.4TGF?β1誘導前后A549細胞形態和膠原蛋白表達的影響對照組細胞光鏡下為凸角的鋪路石結構，細胞間存在連接緊密，呈現上皮細胞樣形態；TGF?β110 μmol/L干預組細胞多為紡錘形或星形的扁平細胞樣改變，呈間質細胞樣形態，詳見圖2。Masson染色顯示對照組細胞幾乎未見膠原蛋白表達，而TGF?β110 μmol/L干預組細胞出現大量藍染膠原蛋白，其表達量及表達范圍均明顯增加，詳見圖3。

圖3　兩組細胞Masoon染色（×200）（A為對照組，B為TGF?β1 10 μmol/L干預組）

2.5Western Blot法檢測TGF?β1對A549細胞端粒酶逆轉錄酶蛋白表達結果TGF?β110 μmol/L干預組與對照組比較，A549細胞中端粒酶逆轉錄酶蛋白表達明顯降低（<0.05）。提示TGF?β1抑制了A549細胞端粒酶逆轉錄酶蛋白的表達。詳見表7、圖4。

表7　各組細胞端粒酶逆轉錄酶蛋白相對表達量

圖4　Western Blot檢測各組細胞端粒酶逆轉錄酶蛋白相對表達量

（A為條帶圖；B為柱狀圖）

3 討論

特發性肺纖維化是不可逆的間質性肺病，其病理特征是肺泡上皮細胞持續損傷引起肺間質細胞外基質（ECM）大量沉積，間質組織瘢痕形成，導致肺結構被破壞，肺功能進行性下降[10]。肺組織纖維化重塑的發病機制是一個動態、協調的過程，與衰老密切相關[11]。流行病學顯示，特發性肺纖維化隨著年齡的增長，患病率、死亡率逐漸升高[12]。證據表明，衰老因素參與了特發性肺纖維化的發生、發展[13]，包括基因組不穩定性、表觀遺傳改變、蛋白質穩態喪失、線粒體功能障礙、干細胞衰竭、細胞間通路改變、端?？s短等[14?15]。研究發現，多種細胞因子（如腫瘤壞死因子?α、白細胞介素?1β、白細胞介素?6、白細胞介素?8等）、趨化因子、生長因子[成纖維細胞生長因子（FGF），TGF?β1等]、基質金屬蛋白酶(如MMP?2、MMP?9等)和白三烯[16]的異常表達與肺纖維化的形成有密切關系。其中，TGF?β1是促進組織發生纖維化和細胞衰老的關鍵致病因子，能誘導A549細胞建立肺纖維化模型并發生復制性衰老。本實驗通過在A549細胞中加入TGF?β1的方式建立肺纖維化衰老模型，探究DNA甲基化和端粒酶的變化。

從β?gal染色結果可以看出，對照組幾乎未出現衰老細胞，而TGF?β1干預組隨著TGF?β1濃度的不斷升高，衰老細胞增多，證實了TGF?β1促進了A549細胞發生衰老。前期研究表明，TGF?β可以引起白細胞介素?1β[17]、白細胞介素?6等炎性衰老因子水平的升高[16]，導致高促炎癥反應狀態，也進一步加速特發性肺纖維化的發生、發展。本實驗發現，白細胞介素?1β和白細胞介素?6在肺纖維化復制性衰老模型中顯著增加，證實TGF?β1明顯促進了A549細胞白細胞介素?1β和白細胞介素?6和mRNA的表達，也證實炎癥因子在細胞衰老中起重要作用。從結果可以看出TGF?β15 μmol/L干預組與TGF?β110 μmol/L干預組作用相當，因此，后續實驗選擇TGF?β110 μmol/L干預組與對照組進行研究和結果比較。

通過觀察細胞形態和Masson染色可以看到TGF?β1誘導的A549細胞出現了明顯的纖維化改變，也與前期實驗中肺纖維化小鼠肺組織膠原表達增多的結果相一致。COL?I、FN1、Tensin?C也被認為是纖維化形成的表型[18]。本研究結果顯示，TGF?β1干預組A549細胞COL?I、FN1、Tensin?C表達明顯升高，可以認為TGF?β1促進了A549細胞COL?I、FN1、Tensin?C的表達，加速了A549細胞纖維化進程。證明了TGF?β1是強大的致纖維化因子，可以改變A549細胞形態變化，增強膠原蛋白的表達。

研究發現，細胞復制性衰老與端?？s短有關，端粒酶是一種逆轉錄酶，包括調節亞基、端粒酶RNA成分(TERC)和端粒酶逆轉錄酶，其在維持端粒長度上發揮關鍵作用[19]。其中端粒酶逆轉錄酶基因轉錄調控是人端粒酶活性調節的一個主要機制，可反映端粒酶活性。端粒酶相關基因突變約占家族性肺纖維化（FPF）病例總數的25%，在散發性特發性肺纖維化中占1%～3%[20?21]。Naikawadi等[22]在小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中發現，TRFl缺失會導致端粒縮短和肺重構，主要表現為肺泡間隔增厚、間質膠原纖維沉積、羥脯氨酸含量增加及β半乳糖苷酶累積。據報道，端粒酶逆轉錄酶在上皮細胞中的表達能夠抵抗博來霉素誘導的肺纖維化，而缺乏端粒酶逆轉錄酶會影響上皮細胞的增殖，并可能導致上皮再生受損，并導致肺纖維化加重[23]。在本實驗中TGF?β1干預組與對照組比較，A549細胞端粒酶逆轉錄酶蛋白表達明顯降低，提示TGF?β1通過抑制A549細胞中端粒酶逆轉錄酶的表達降低了端粒酶的活性，表明端粒酶逆轉錄酶活性減弱與細胞衰老有關。也有研究發現，端粒酶逆轉錄酶缺乏會影響上皮細胞的增殖，并可能導致上皮細胞再生受損使肺纖維化加重[23]，與本研究結果一致。

表觀遺傳因素改變導致特發性肺纖維化肺組織中基因表達失調，最常見的表觀遺傳機制包括DNA甲基化和組蛋白修飾以及非編碼RNA（NcRNA）調控[24]。DNMT3a、DNMT3b是DNA甲基化的關鍵限速因子。Velagacherla等[25]研究提示特發性肺纖維化中DNMT3a、DNMT3b表達增加，而細胞黏附相關基因CDH1甲基化可能參與特發性肺纖維化發病，CDH1編碼的E?鈣黏素（E?cad）是上皮細胞的標志蛋白，對細胞極性和組織完整性的維持具有重要作用。E?鈣黏素水平下降是促進上皮間質轉化發生的重要因素之一，可導致細胞黏附力降低，促進特發性肺纖維化發生[26]。另有研究指出，TGF?β1是一種DNA甲基化調節劑，影響著一些重要元素[27]。本實驗中TGF?β1干預組與對照組比較，A549細胞CDH1表達明顯降低，這也進一步說明了CDH1降低，其編碼的上皮表型的標志蛋白E?鈣黏素水平有可能下降，導致細胞黏附力降低，也進一步加快了纖維化的進程。Negreros等[24]研究結果表明，TGF?β1誘導成纖維細胞DNMT3a和TET3的表達上調，并導致成纖維細胞的DNA甲基化模式發生深刻變化。本實驗TGF?β1干預組與對照組相比較顯示A549細胞DNMT3a和DNMT3b 表達明顯升高，與Negreros等[24?25]的研究結果一致。

目前，已有研究證實DNA甲基化限速酶和端粒酶在特發性肺纖維化中起重要調控作用。本研究旨在探究TGF?β1對A549細胞中DNA甲基化關鍵酶DNMT3a、DNMT3b和端粒酶活性標志物端粒酶逆轉錄酶的影響。研究表明，TGF?β1促進了A549細胞發生復制性衰老并導致纖維化改變，同時提示DNA甲基化關鍵限速酶DNMT3a、DNMT3b表達上調和端粒酶活性（端粒酶逆轉錄酶）降低與衰老有關。TGF?β1作為重要的致纖維化因子與DNA甲基化和端粒酶之間有著密切關系，這為治療纖維化提供了方向。中醫認為肺纖維化屬于“肺痿”“肺痹”等范疇，中醫藥治療特發性肺纖維化以副作用少、價格低、藥物依賴性小等優勢逐漸成為熱點[28]。同時，基于韓世范教授等[29]提出的非營養素防治慢性病的理論模型，很多兼具食品和藥品特性的食物成為防治慢性病的新選擇，如水果、蔬菜中含量豐富的多酚類化合物具有抗感染、抗過敏、抗氧化、保護DNA和提高免疫力等多種藥學作用，其中槲皮素作為酚類化合物的一種，廣泛存在于銀杏葉、柴胡等中草藥和蘋果、卷心菜、西藍花等果蔬中[30]。目前，關于中醫藥材和食物對抗纖維化的研究集中在抗氧化、抑制上皮細胞?間充質轉化、抑制細胞自噬、調節免疫平衡、改善細胞外基質沉積等方面[31]，其中作用最顯著的是抑制TGF?β信號通路。最近越來越多研究發現中藥材通過表觀遺傳修飾發揮抗纖維化作用[7]。本研究也為探索藥食同源物質發揮抗纖維化作用機制提供了思路。

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Regulatory mechanism of TGF?β1on DNA methylase and telomerase in human alveolar epithelial cells

SUNZiyue, QIANLi, LIDan, ZHURuifang, HANYongkang, LIUXuejun

Shanxi Medical University, Shanxi 030001 China

Changes in DNA methylase and telomerase were observed by TGF?β1?induced human alveolar epithelial cells A549.A549 cells were induced by TGF?β1to establish an in vitro pulmonary fibrosis model，which was divided into a control group，TGF?β12μmol/L intervention group，TGF?β15 μmol/L intervention group，and TGF?β110 μmol/L intervention group.β?gal staining to detect the degree of cell senescence；ELISA and RT?qPCR detected the expression of inflammatory factors IL?1β and IL?6.RT?qPCR detects the expression of Type I collagen（COL?I），Fibronectin 1（FN1），Tensin?C，DNMT3a，DNMT3b，CDH1，and TERT mRNA.Western Blot method detected TERT protein expression.There were almost no senescent cells in the control group，and the degree of senescence of cells in the intervention group increased with the increase of TGF?β1concentration；IL?1β and IL6 expression were significantly increased in the TGF?β1intervention group（<0.05）；The A549 cell morphology of the control group showed a typical epithelial cell?like morphology，and the TGF?β1 intervention group had a typical mesenchymal cell?like morphology，and the Masson staining results showed that the control group cells hardly saw blue collagen，while the expression of indigen?stained collagen in the TGF?β1intervention group was significantly increased；Compared with the control group，the expression of COL?I，FN1，Tensin?C，DNMT3a，and DNMT3b mRNA was significantly increased（<0.05），the expression of mRNA of TERT and CDH1 genes was reduced（<0.05），and the expression of TERT protein was further verified by Western Blot（<0.05）.TGF?β1can induce senescence of A549 cells，and promote the high expression of inflammatory factors and fibrogenic factors，resulting in fibrosis changes.TGF?β1promoted the expression of DNA methylase and inhibited the expression of TERT.

idiopathic pulmonary fibrosis， IPF； TGF?β1； A549 cells； DNA methylation； TERT

10.12102/j.issn.1009-6493.2023.12.010

（2023?02?16；

2023?05?24）

山西省應用基礎研究項目自然科學基金項目，編號：201601D011105；山西省應用基礎研究項目青年科技研究基金項目，編號：201701D221271

孫梓越，醫師，碩士

劉學軍，E?mail：lxj20041205@sina.com

孫梓越,錢力,李丹,等.TGF?β1調控人肺泡上皮細胞中DNA甲基化酶和端粒酶的機制[J].護理研究,2023,37(12):2138?2143.

LIU Xuejun, E?mail: lxj20041205@sina.com

（本文編輯 曹妍）