響應面法優化甘蔗芭蕉復合發酵液的制備工藝

余森艷 何澤 蘇秀芳 盧珍蘭 李志紅 王強

（1. 廣西民族師范學院化學與生物工程學院 廣西崇左 532200；2. 廣西民族師范學院甘蔗產業鏈協同創新中心 廣西崇左 532200）

被譽為“中國糖都”的廣西崇左市，是全國甘蔗種植和蔗糖生產的最大基地[1-2]。甘蔗汁多味甜，還富含多酚、黃酮等成分，抗氧化、抗炎癥、抗基因變異的作用較強[3-4]。甘蔗是我國糖業的重要組成部分，但其產業鏈比較單一，且制糖后營養成分會有所損失，若將甘蔗直接用于食品深加工領域將大有可為。芭蕉是熱帶地區盛產的一種藥食兼用的水果，在我國南方大部分地區，如廣西、云南、海南等地都有栽培[5]。芭蕉含有多種維生素、糖類以及鈣、磷、鐵等微量元素，營養價值高[6]，味道清甜爽口，且具有開胃消食等功效。但芭蕉成熟后不耐貯藏運輸，鮮銷能力有限，深加工目前還比較匱乏。

復合水果發酵液，是以多種鮮果為原料，經過酵母菌、乳酸菌等微生物發酵而成的功能性發酵液[7]。通過益生菌發酵后，水果中的有益成分能保留在產品中，而且水果中所富含的花青素以及多種酶類，如蛋白酶、多酚氧化酶、SOD（超氧化物歧化酶）等[8]，使得發酵液具有抗氧化、抗衰老、抑菌的功效[9]。同時，多種益生菌混合發酵，協同作用，還可以賦予產品獨特的風味，提升其保健功能[10]。將甘蔗與芭蕉復合制備成水果發酵液能充分利用我國廣西地區甘蔗、芭蕉資源，解決芭蕉不耐貯運的困境，促進當地經濟發展，開拓農產品資源利用途徑，還能將甘蔗和芭蕉中特有的營養成分和豐富的活性物質通過益生菌發酵來提升其營養價值及功能特性，為新型水果復合發酵液的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗、芭蕉，崇左農貿市場；精幼砂糖，安琪酵母（赤峰）有限公司；檸檬酸（食品級），山東濰坊英軒實業有限公司；VC（食品級），河南萬邦實業有限公司；酵母菌（SY 型果酒專用酵母）、乳酸菌（由嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌組合的2 菌型乳酸發酵劑），安琪酵母股份有限公司。

95%乙醇溶液、0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液、Tris-HCl 緩沖液，飛凈生物科技有限公司；0.1 mol/L 鹽酸溶液，深圳市鋮遠科技有限公司；1%酚酞溶液，廣西和為醫藥科技有限公司；DPPH，合肥巴斯夫生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸、過氧化氫，成都市科隆化學品有限公司。

BD-320HEM 冰箱，青島海爾特種電冰柜有限公司；JYZ-E3C 原汁機，九陽股份有限公司；YP5002 電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；C21-WT2103A 電磁爐，廣東美的生活電器制造有限公司；PAL-1 數顯折射計，廣州市愛宕科學儀器有限公司；AK002C 數顯糖度計，深圳市測友科技有限公司；UV759CRT 紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；LRHS-250-II 恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程① 甘蔗→去皮切塊→壓榨→過濾→甘蔗原汁；

② 芭蕉→去皮切塊→滅酶→護色打漿→芭蕉漿；

1.2.2 操作要點（1）甘蔗原汁的制備 選擇汁液較多、無霉變的甘蔗，清洗、去皮、切塊，壓榨滅菌獲得甘蔗原汁，備用。

（2）芭蕉漿的制備 選擇新鮮無腐爛，成熟度適中的芭蕉，去皮切塊后過沸水熱燙2 min 滅酶，按料液比1:3（m:m）比例加入清水，再分別加入0.05%的維生素C 和檸檬酸，混合均勻后打漿，獲得芭蕉漿備用。

（3）混合調糖 以1:1（m:m）的比例將甘蔗原汁、芭蕉漿混合均勻，再添加蔗糖調整到適宜的糖度。

（4）殺菌、冷卻 滅菌溫度為100℃，保持15 min。殺菌后立即冷卻至室溫。

（5）酵母菌發酵 向混合液中加入果酒專用酵母并攪拌均勻，然后放入恒溫培養箱中，調整發酵溫度進行發酵，發酵時間為20～28 h。

（6）乳酸菌發酵 待酵母菌發酵結束后，向發酵液中添加乳酸菌并攪拌均勻，在恒溫培養箱中進行二次發酵，調整適宜的發酵溫度，發酵時間為6～14 h。在發酵期間注意保持溫度恒定，以更好地促進發酵液風味物質的形成。

1.2.3 酵母菌發酵單因素試驗設計（1）初始糖度對復合發酵液品質的影響 在酵母菌添加量為0.5%（調糖后原料質量比，下同）、發酵溫度為30℃、發酵時間為24 h 條件下發酵，探究初始糖度分別為12%、14%、16%、18%、20%對復合發酵液品質的影響，以確定適宜的初始糖度。

（2）酵母菌添加量對復合發酵液品質的影響 在初始糖度為16%、發酵溫度為30℃、發酵時間為24 h 條件下發酵，探究酵母菌添加量分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%對復合發酵液品質的影響，以確定酵母菌添加量的適宜范圍。

（3）發酵溫度對復合發酵液品質的影響 在初始糖度為16%、酵母菌添加量為0.5%、發酵時間為24 h 條件下發酵，探究發酵溫度分別為26、28、30、32、34℃對復合發酵液品質的影響，以確定適宜的發酵溫度。

（4）發酵時間對復合發酵液品質的影響 在酵母菌添加量為0.5%、初始糖度為16%、發酵溫度為30℃條件下發酵，探究發酵時間分別為20、22、24、26、28 h 對復合發酵液品質的影響，以確定發酵時間的適宜范圍。

（5）酵母菌發酵復合發酵液的感官評價標準 由10 名食品專業感官評價員（5 名男生和5名女生組成，具有一定的食品感官評價理論基礎，下同）對酵母菌發酵階段甘蔗芭蕉復合發酵液的色澤、香氣、口感、組織形態進行感官評定。感官評分標準如表1 所示，感官評價結果取平均值。

表1 酵母菌發酵階段復合發酵液的感官評價標準

（6）響應面試驗設計 在單因素試驗設計的基礎上，以感官評分（Y）為響應值，初始糖度（A）、酵母菌添加量（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）4 個因素進行響應面分析試驗，得出最佳工藝組合，并確定甘蔗芭蕉復合發酵液在酵母菌發酵階段的最佳工藝條件。試驗因素水平設計如表2 所示。

表2 響應面試驗因素水平設計

1.2.4 乳酸菌發酵單因素試驗設計在酵母菌發酵的基礎上，加入乳酸菌進行第二次發酵。

（1）乳酸菌添加量對發酵液品質的影響 在發酵溫度42℃、發酵時間10 h 條件下發酵，探究乳酸菌添加量分別為2%、2.5%、3%、3.5%、4%對復合發酵液品質的影響，以確定適宜的乳酸菌添加量范圍。

（2）發酵時間對發酵液品質的影響 在發酵溫度42℃、乳酸菌添加量3%條件下發酵，探究發酵時間分別為6、8、10、12、14 h 對復合發酵液品質的影響，以確定發酵時間的適宜范圍。

（3）發酵溫度對發酵液品質的影響 在乳酸菌添加量3%、發酵時間10 h 條件下發酵，探究發酵溫度分別為40、41、42、43、44℃對復合發酵液品質的影響，以確定適宜的發酵溫度。

（4）乳酸菌發酵后復合發酵液的感官評價標準 由10 名食品專業感官評價員對乳酸菌發酵階段甘蔗芭蕉復合發酵液的色澤、香氣、口感、組織形態進行感官評定。感官評分標準如表3 所示，感官評價結果取平均值。

表3 乳酸菌發酵階段復合發酵液的感官評價標準

（5）正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，通過感官評價的方法，以乳酸菌添加量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）為考察因素進行正交優化試驗，以感官評價標準為評定依據，確定甘蔗芭蕉復合發酵液乳酸菌發酵階段的最佳工藝，試驗因素水平見表4。

表4 正交試驗因素水平表

1.2.5 項目測定以最佳配方生產的甘蔗芭蕉復合發酵液為樣品，測定其主要理化指標。

（1）pH 使用酸度計測定。

（2）糖度 數顯糖度測定儀測定。

（3）可溶性固形物含量（TSS） 用數顯折射計測定。

（4）酸度 參照《食品安全國家標準 食品酸度的測定》（GB 5009.239—2016）方法檢測。

（5）抗氧化能力的測定[11-12]① DPPH 自由基清除能力的測定，取0.2 mL 試樣加入到1.8 mL水中，然后再加入2 mL 0.1 mmol/L 的DPPH 的乙醇溶液，樣品搖勻后在室溫下避光反應30 min，利用分光光度計測定517 nm 處的吸光值。發酵前樣品代替試樣作為自身對照組。重復測定3 次，結果取平均值。DPPH 清除率按照式（1）計算。

式中：Ai為2 mL DPPH 和2 mL 試樣混合后在517 nm 處的吸光值；Aj=2 mL 試樣和2 mL 乙醇混合后在517 nm 處的吸光值；A0=2 mL DPPH和2 mL 乙醇混合后在517 nm 處的吸光值。

② 羥自由基清除能力的測定，將 1 mL 9 mmol/L FeSO4、1.0 mL 9 mmol/L 水楊酸及1 mL的試樣加入到試管中，再加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液啟動反應，于37℃下反應30 min，利用分光光度計測定510 nm 處的吸光值?？瞻讟悠芬哉麴s水替代試樣。發酵前樣品代替試樣作為自身對照組。重復測定3 次，結果取平均值。羥自由基清除率利用式（2）計算。

式中：Ax為試樣吸光度；A0為空白對照樣品吸光度；Ax0為水替代H2O2的本底吸光度。

③ 超氧陰離子自由基清除能力的測定，取1 mL 試樣和0.4 mL 25 mmol/L 鄰苯三酚溶液加入到4.5 mL pH 8.2 的Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L）中靜置反應25 min，加入1 mL 8 mmol/L 的HCl溶液結束反應，然后利用分光光度計測定樣品299 nm 處的吸光度值。發酵前樣品代替試樣作為自身對照組。重復測定3 次，結果取平均值。超氧陰離子自由基清除率利用式（3）計算。

式中：Ax為試樣吸光度；A0為空白對照樣品吸光度；Ax0為水替代鄰苯三酚的本底吸光度。

1.2.6 數據處理

運用Excel 完成數據整理，SPSS 20.0 軟件進行方差分析及顯著性差異分析，利用Origin 2019軟件完成單因素試驗作圖，運用Design-Expert 8.0.6軟件完成響應面試驗作圖及數據分析。

2 結果與分析

2.1 酵母菌發酵單因素試驗結果與分析

2.1.1 初始糖度對甘蔗芭蕉復合發酵液的影響由圖1 可知，隨著初始糖度的增加，感官評分先升后降，當初始糖度為16%時，感官評分最高，此時的發酵液酒香協調，口感柔和。初始糖度為12%時，發酵出來的發酵液酒香較淡，口感一般，且甜度低；初始糖度為20%時，所得的發酵液幾乎沒有酒香，且口感甜膩，可能是由于糖分含量太高，導致復合發酵液的滲透壓較大，對發酵過程中的酵母菌生長造成不利影響，甚至使其凋亡[13]，發酵難以進行。因此，選用初始糖度14%、16%、18%進行響應面優化試驗。

圖1 初始糖度對酵母菌發酵階段感官評價的影響

2.1.2 酵母菌添加量對甘蔗芭蕉復合發酵液的影響由圖2 可知，酵母菌添加量在0.4%、0.5%、0.6%時，感官評分較高，所得的發酵液香氣純正、風味濃郁。菌種添加量為0.3%，發酵液酒香不足，口感平淡，略微甜膩，可能是果酒酵母菌數量偏少，未能充分利用發酵液的糖類物質發酵；當酵母菌添加量為0.7%時，所得到的發酵液香氣過于濃郁，且味道偏苦，滋味不柔和，可能是因為酵母菌添加量過多，糖分消耗迅速，酵母菌代謝速率快，產生大量的副產物，使感官得分降低[14]。因此，選用酵母菌添加量0.4%、0.5%、0.6%進行響應面優化試驗。

圖2 酵母菌添加量對酵母菌發酵階段感官評價的影響

2.1.3 發酵溫度對甘蔗芭蕉復合發酵液的影響由圖3 可知，隨著發酵溫度的增加，復合發酵液的感官評分升高，隨后又下降，在發酵溫度為30℃時達到最高。溫度為26 和34℃時，感官評分相對較低，可能是因為溫度偏低，果酒酵母生長速度慢，發酵不夠完全；發酵溫度偏高時，果酒酵母代謝增強，衰老加快，對產品的風味和口感產生不利影響。因此，選用發酵溫度為28、30、32℃進行響應面優化試驗。

圖3 發酵溫度對酵母菌發酵階段感官評價的影響

2.1.4 發酵時間對甘蔗芭蕉復合發酵液的影響由圖4 可知，感官評分隨著發酵時間的增加而上升，在26 h 時感官評分達到最高，所得的發酵液香氣協調，風味最佳，而發酵時間為20 h 時，感官評分較低，復合發酵液香氣不足，口感平淡。當發酵時間超過26 h 時，甘蔗芭蕉復合發酵液的口感略帶苦澀，氣味不協調。因此，選用發酵時間22、24、26 h 進行響應面優化試驗。

圖4 發酵時間對酵母菌發酵階段感官評價的影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析利用Design-Expert 8.0.6 軟件對響應面試驗進行設計，結果如表5 所示。對表5 中實驗數據進行回歸擬合，得到自變量（A初始糖度、B酵母菌添加量、C發酵溫度、D發酵時間）與感官評分（Y）的二次多項回歸方程為：

表5 響應面試驗方案及結果

對表5 試驗結果進行方差分析，結果見表6，該回歸模型p＜0.05，方程模型顯著，失擬項p=0.521 9＞0.05，不顯著；該回歸模型的決定系數R2=0.833 9，調整決定系數R2Adj=0.667 9，變異系數CV=1.95。試驗結果表明，模型具有較好的適用性，試驗的誤差較低，因此所建立的回歸方程的模型可以采用，利用該模型可以分析和預測甘蔗芭蕉復合發酵液酵母菌發酵階段的發酵工藝條件。

由表6 可知，甘蔗芭蕉復合發酵液酵母菌發酵階段的工藝參數中，影響感官評分的因素按主次順序排列：初始糖度（A）＞酵母菌添加量（B）＞發酵溫度（D）＞發酵時間（C），其中模型一次項A初始糖度影響極顯著，B酵母菌添加量、D發酵溫度顯著，C發酵時間不顯著；二次項B2、D2極顯著，A2顯著，C2不顯著；交互項影響均不顯著。

2.2.2 各因素交互作用的響應面采用Design Expert 8.0.6 軟件對影響甘蔗芭蕉復合發酵液酵母菌發酵階段的4 個因素進行交互分析，結果見圖5。

用Design Expert 8.0.6 響應面分析軟件優化試驗結果，通過回歸模型優化后的復合發酵液酵母菌發酵階段最佳工藝條件為初始糖度16%、酵母菌添加量 0.48%、發酵時間 22 h、發酵溫度30.18℃，在該條件下感官評分的預測值是90.89分。根據試驗條件調整初始糖度為 16%、酵母菌添加量為0.5%、發酵時間為22 h、發酵溫度30℃，按此條件進行3 次重復試驗，所得甘蔗芭蕉復合發酵液酵母菌發酵的感官評分平均值為89.66 分，與預測值接近，表明響應面法所獲得的模型參數是準確可靠的，能有效反映出各因素對甘蔗芭蕉復合發酵液的發酵效果。

2.3 乳酸菌發酵單因素試驗結果分析

2.3.1 乳酸菌添加量對甘蔗芭蕉復合發酵液的影響由圖6 可知，當乳酸菌的添加量低于3%時，復合發酵液的感官評分較低，口感偏差，原因可能是發酵菌種產酸不足，復合發酵液沒有得到充分發酵。當乳酸菌添加量增加到3%時，感官評價分達到最高，此時復合發酵液香氣協調，口感最佳，滋味酸甜適中，組織狀態均勻。當乳酸菌添加量大于3.0%時，菌種發酵產酸能力過強，口感偏酸。因此，選擇該因素進行正交試驗的3 個水平為2.5%、3.0%、3.5%。

2.3.2 發酵時間對甘蔗芭蕉復合發酵液的影響由圖7 可知，感官評分隨著發酵時間的增加而上升，當發酵時間為12 h 時，感官評分達到最大值，復合發酵液的品質較好。當發酵時間超過 12 h時，感官評分顯著下降，原因可能是發酵時間偏長，菌種大量繁殖，過多消耗了復合發酵液中的養分，從而使復合發酵液的味道變得酸澀、氣味不協調[15]。因此，選擇該因素進行正交試驗的3個水平為8、10、12 h。

圖7 發酵時間對乳酸菌發酵階段感官評價的影響

2.3.3 發酵溫度對甘蔗芭蕉復合發酵液的影響溫度是影響乳酸菌生長發育及新陳代謝的主要因素。由圖8 可知，在40～42℃時，感官評分隨著發酵溫度的升高而上升，超過43℃后感官評分明顯下降，主要原因可能是溫度偏低時，乳酸菌生長速度慢，新陳代謝速率低；溫度較高時，酸化速度加快，對風味物質的生成不利，使得復合發酵液口感酸澀。因此選擇該因素進行正交試驗的3 個水平為41、42、43℃。

圖8 發酵溫度對乳酸菌發酵階段感官評價的影響

2.3.4 乳酸菌發酵工藝優化正交試驗根據乳酸菌發酵的單因素試驗結果，以感官評分作為指標，選擇三因素三水平L9（33）進行正交試驗，考察A乳酸菌添加量（%）、B發酵時間（h）、C發酵溫度（℃）3 個因素對甘蔗芭蕉復合發酵液乳酸菌發酵階段的影響。乳酸菌發酵工藝優化正交實驗結果如表7 所示，方差分析結果如表8所示。

表7 乳酸菌發酵工藝優化正交實驗結果

表8 方差分析結果

由表7 可知，A2B3C3為最佳工藝組合，即乳酸菌添加量為3%、發酵時間為12 h、發酵溫度為43℃。從試驗結果可以看出，影響甘蔗芭蕉復合發酵液乳酸菌發酵階段感官評分的3 個因素主次順序依次為A＞C＞B。由表8 可知，乳酸菌添加量的影響極顯著，發酵溫度的影響顯著，發酵時間的影響不顯著。

2.3.5 驗證試驗結果分析由于正交試驗表中沒有出現最佳工藝組合A2B3C3，對此進行驗證試驗，在最佳工藝條件為乳酸菌添加量3%、發酵時間12 h、發酵溫度43℃的情況下，進行3 次平行試驗并取平均值，得到甘蔗芭蕉復合發酵液的感官評分為87.67 分，與正交試驗表7 中所有因素組合相比，感官評分較高，可將A2B3C3作為甘蔗芭蕉復合發酵液乳酸菌發酵工藝的最佳組合。

2.4 甘蔗芭蕉復合發酵液體外抗氧化活性測定結果

根據甘蔗芭蕉復合發酵的最優制備工藝條件，對其進行體外抗氧化能力測定，同時以未發酵時的樣品做為自身對照。結果如表9 所示，經酵母菌和乳酸菌共同發酵之后，甘蔗芭蕉復合發酵液較未發酵之前的抗氧化能力得到了較大提升，這與侯金麗[16]研究刺梨植物乳桿菌發酵飲料時的結果類似。

表9 甘蔗芭蕉復合發酵液抗氧化能力測定結果單位：%

3 結論

以甘蔗、芭蕉為原料，兩原料以1:1（m:m）的比例混合均勻，采用酵母菌和乳酸菌協同發酵，制備甘蔗芭蕉復合發酵液。在單因素試驗的基礎上進行響應面分析，得出酵母菌發酵的最優工藝條件：初始糖度16%、酵母菌添加量0.5%、發酵溫度30℃、發酵時間22 h；通過正交試驗分析得出乳酸菌發酵的最優工藝條件：乳酸菌添加量3%，發酵時間12 h，發酵溫度43℃。在此工藝條件下制備的甘蔗芭蕉復合發酵液色澤呈淡黃色，酸甜適宜，香氣協調,口感醇厚。發酵后的甘蔗芭蕉復合發酵液pH、可溶性固形物含量、總酸分別為4.2、13.5%、3.95 g/100 mL。在最優條件下對甘蔗芭蕉復合發酵液進行體外抗氧化活性測定，發現該復合發酵液具有一定的抗氧化能力，DPPH自由基清除率達到60.97%，羥自由基清除率為45.09%，超氧自由基清除率為50.7%。

本研究采用酵母菌、乳酸菌協同發酵，不僅增加了產品的風味物質，還可調節人體腸道菌群，促進代謝和能量吸收，能較好地滿足人們對水果復合發酵液飲品在營養、健康方面的追求，同時也可為廣西甘蔗、芭蕉產業的深加工提供參考依據。