miR-876-5p通過負反饋調節上皮-間質樣轉化在胃癌進展中的作用及機制研究

崔 琴, 趙翠娟, 屈振杰

(內蒙古包鋼醫院, 內蒙古 包頭 014010)

胃癌是全球最具侵襲性的惡性腫瘤之一,也是全球癌癥相關死亡的第三大原因,其進展快速且高度轉移的生物學特性是導致患者死亡率居高不下的關鍵因素[1]。近年來,盡管早期診斷和治療取得了進展,但胃癌患者尤其是轉移性胃癌患者的預后仍然較差。上皮-間質樣轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質細胞轉化的過程,在腫瘤進展如侵襲和轉移中起著關鍵作用,腫瘤細胞可以通過EMT變得更具侵襲性。在臨床診療中,EMT與胃癌患者的預后不良密切相關[2]。因此,需要更好地了解胃癌轉移中調控EMT過程的關鍵靶點及潛在機制,制定阻斷腫瘤的侵襲轉移過程以對抗胃癌進展的有效治療策略。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是內源性非編碼調節RNA,具有17～25個核苷酸,在轉錄后基因調控中起重要作用,通過與對應靶標mRNA的3'-非翻譯區域結合互補,導致mRNA降解或翻譯抑制,從而調節基因表達。miRNA參與調節多種生物學過程,如細胞增殖、轉移、分化、凋亡、EMT等。越來越多的研究表明,miRNA的異常表達與腫瘤發生發展密切相關,胃癌組織和胃癌細胞系中miRNA表達失調有助于腫瘤發生,且表達特征可能與不同的癌癥類型和臨床病理特征相關[3]。miR-876-5p的表達與功能已經在多種類型的癌癥中進行了研究,包括肺癌、肝細胞癌、乳腺癌等[4],此外,已有研究證實miR-876-5p在胃癌腫瘤組織中的表達水平較低,過表達miR-876-5p抑制了胃癌細胞增殖并促進了細胞凋亡[5]。但miR-876-5p在胃癌EMT中的作用機制及與EMT介導胃癌進展的之間的關系尚待明確。本研究進一步檢測了胃癌組織內miR-876-5p表達變化,探究了miR-876-5p在TGF-β1誘導胃癌EMT過程及進展中的作用及具體機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選取2021年6月至2022年4月期間在我院行胃癌根治性手術的49例患者的腫瘤組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣5cm以上),切除后立即置于液氮中,然后保存于-80℃冰箱,所有腫瘤標本經病理檢查明確診斷為胃癌。其中女性22例,男性27例,年齡42～70歲,平均年齡(56.80±5.46)歲,術前均未進行過放化療、靶向治療、免疫治療等其他治療,排除患有心、肝、腎等器臟疾病或其他惡性腫瘤患者。所有患者同意進行此研究并簽署知情同意書,也獲得我院醫學倫理委員會批準同意。

1.2主要材料與試劑:人胃癌細胞系BGC-823購于蘇州思瑞坦細胞庫。胎牛血清、雙抗液及DMEM培養基購于美國Gibco公司,TGF-β1購于美國Sigma公司,Trizol試劑盒和LipofectamineTM2000試劑盒購于美國Invitrogen公司,miRNA反轉錄與定量檢測試劑盒購于日本Takara公司,CCK-8試劑盒購于北京索萊寶生物公司,EdU染色試劑盒購于廣州銳博生物公司,Transwell小室和Matrigel膠購于美國Corning公司,Triton X-100購于北京百奧萊博公司,結晶紫染液、Hoechst染液、DAPI染液、RIPA裂解液、ECL顯色液及PVDF膜購于上海碧云天生物研究所,兔抗E-cadherin多克隆抗體、兔抗Vimentin多克隆抗體、兔抗N-cadherin多克隆抗體、兔抗Snail多克隆抗體、兔抗MMP-2多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體、兔抗ERK1/2多克隆抗體及兔抗p-ERK1/2多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體、Alexa Fluor標記的山羊抗兔IgG抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或驢抗兔均購于英國Abcam公司。

1.3方 法

1.3.1實時熒光定量PCR反應:將凍存的胃癌組織及癌旁正常組織取出,無菌環境下剪碎,加入液氮研磨成粉末狀,采用Trizol法提取總RNA,超微量分光光度計測定樣品的吸光度值,鑒定RNA純度、濃度。Real-time PCR實驗將總RNA反轉錄為cDNA。以U6做為內參基因,根據miRNA定量檢測試劑盒說明書配制20μL PCR反應體系,依次加入底物與各試劑后,將該體系置于定量檢測系統上進行實時熒光定量PCR反應,設置反應程序為:95℃ 10min預變性,循環1次;95℃ 10s,60 ℃ 30s,循環40次。實驗引物序列如下:miR-876-5p Forward 5′-TGGATTTCTTTGTGAATCACCA-3′,Reverse 5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′;U6 Forward 5′-GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′,Reverse 5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′。擴增結束后,生產溶解曲線,將閾值設定在熒光值對數圖的線性部分,讀取Ct值,根據2-ΔΔCt法計算miR-876-5p相對表達量。

1.3.2細胞實驗分組與處理:將胃癌細胞系BGC-823置于37℃、5%CO2孵箱,使用含10%胎牛血清及雙抗液的DMEM培養基培養24h至細胞匯合度達80%,調節密度為3×105個的細胞數量接種于6孔板培養,次日,棄原培養液,將細胞分為5組:①對照組,胃癌細胞正常培養;②EMT組,參照文獻方法[6]加入5ng/mL TGF-β1誘導24h以建立胃癌細胞EMT模型;③miR-NC+EMT組,將miR-NC轉染至胃癌細胞后再建立EMT模型;④miR-876-5p+EMT組,將miR-876-5p轉染至胃癌細胞后再建立EMT模型;⑤miR-876-5p+EMT+ISO組,將miR-876-5p轉染至胃癌細胞后建立EMT模型,同時以20μmoL LL ERK信號通路激活劑ISO處理24h。細胞轉染實驗中,利用LipofectamineTM2000試劑盒將miR-876-5p mimic或miR-NC轉染至胃癌細胞,具體按照制造商說明書進行操作。

1.3.3免疫熒光染色:將處理后的各組胃癌細胞接種至防脫載玻片上,利用4%多聚甲醛固定,滴加0.1%Triton X-100室溫孵育10min,再以10%山羊血清室溫封閉2h。將兔抗E-cadherin多克隆抗體、兔抗Vimentin多克隆抗體、兔抗N-cadherin多克隆抗體均稀釋為1∶200,再滴加適量抗體工作液覆蓋玻片,置于4℃冰箱孵育過夜。取出玻片,常溫復溫30min后,PBS清洗,滴加稀釋的Alexa Fluor標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶500),置于37℃培養箱孵育30min,PBS清洗,加入DAPI避光染核10min,PBS再次清洗,封片,自然晾干,通過熒光顯微鏡觀察細胞染色情況并采集圖像。

1.3.4Western blot:在收集的胃癌細胞中加入RIPA裂解液,超聲粉碎,置于冰上裂解30min,低溫離心機4℃下以12000rpm離心10min,取上清,即為蛋白樣品,BCA法測定濃度。將等量緩沖液與蛋白混勻,100℃煮沸變性,取40μg蛋白樣品上樣至10%SDS-PAGE凝膠孔內,固定電泳裝置,電泳分離蛋白,電轉至PVDF膜,室溫下以5%脫脂奶粉封閉1h。將兔抗E-cadherin多克隆抗體、兔抗Vimentin多克隆抗體、兔抗N-cadherin多克隆抗體、兔抗Snail多克隆抗體、兔抗MMP-2多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體、兔抗ERK1/2多克隆抗體及兔抗p-ERK1/2多克隆抗體均按照1∶1000稀釋后,與膜在4℃冰箱內共孵育過夜。TBST洗膜,滴加稀釋后的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或驢抗兔(1∶5000),室溫孵育1h。ECL顯色曝光,紫外凝膠成像儀拍照,采用ImageJ軟件分析各蛋白條帶灰度值,以GAPDH作為內參蛋白,以目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度值之比表示目的蛋白相對表達量。

1.3.5CCK-8法:將處理后的各組胃癌細胞置于37℃、5%CO2孵箱,分別在0、24、48、72h進行CCK-8實驗,在每孔加入10μLCCK-8試劑液,輕柔混勻,繼續放入孵箱內培養2h,通過酶標儀檢測各孔細胞在450nm波長處的光密度值,并記錄分析。

1.3.6EdU染色:將處理后的胃癌細胞濃度調節為1×105個/mL,吸取100μL接種至96孔板,添加10μmoL/L EdU室溫孵育2h,PBS清洗,加入Apollo488室溫避光染色30min,再以Hoechst避光染核30min,PBS清洗后,封片,自然晾干,通過熒光顯微鏡觀察細胞染色情況并采集圖像,鏡下EdU陽性細胞呈綠色。隨機選擇6個視野,計數EdU陽性細胞數目與總細胞數目,分析計算EdU陽性比率,EdU陽性率(%)=EdU陽性細胞數目/總細胞數目×100%。

1.3.7Transwell小室法:收集處理后的各組胃癌細胞,使用不含胎牛血清及雙抗液的DMEM培養基調節細胞濃度為4×104個/mL,吸取100μL細胞懸液加到Transwell小室的上室,在下室加入500μL含10%胎牛血清的DMEM培養液。將Transwell小室置于37℃、5%CO2孵箱培養24h,取出上室,棄下室培養液,置于PBS中清洗,利用4%多聚甲醛固定10min,滴加0.1%結晶紫染色15min,PBS再次清洗,封片,自然晾干,并在光顯微鏡下對遷移細胞進行計數并采集圖像。侵襲實驗中,首先將稀釋的Matrigel膠加入到Transwell小室的上室,37℃下放置至膠凝固,形成基質屏障后再加入細胞,其余步驟均與遷移實驗步驟相同。

2 結 果

2.1胃癌組織及對應癌旁正常組織內miR-876-5p表達比較:實時熒光定量PCR測定結果顯示,相較于癌旁正常組織,胃癌組織中miR-876-5p相對表達量顯著下降,差異具有統計學意義(P<0.05),見圖1。

圖1 胃癌組織及對應癌旁正常組織內miR-876-5p表達比較注:與癌旁正常組織比較,*P<0.05

2.2各組胃癌細胞上皮-間質樣轉化水平比較:免疫熒光染色結果顯示,與對照組比較,EMT組胃癌細胞E-cadherin熒光表達減弱,Vimentin與N-cadherin熒光表達增強;與EMT組比較,miR-876-5p+EMT組E-cadherin熒光表達增強,Vimentin與N-cadherin熒光表達減弱,而miR-NC+EMT組E-cadherin、Vimentin及N-cadherin熒光表達未發生明顯變化;與miR-876-5p+EMT組比較,miR-876-5p+EMT+ISO組E-cadherin熒光表達減弱,且Vimentin、N-cadherin熒光表達增強,見圖2。

圖2 各組胃癌細胞E-cadherin、Vimentin、N-cadherin熒光表達測定結果(免疫熒光染色,×100)

Western blot測定結果顯示,與對照組比較,EMT組E-cadherin蛋白相對表達量顯著下調,Vimentin、N-cadherin、Snail、MMP-2及MMP-9蛋白相對表達量均顯著上調差,差異具有統計學意義(P<0.05);與EMT組比較,miR-876-5p+EMT組E-cadherin蛋白相對表達量顯著上調而Vimentin、N-cadherin、Snail、MMP-2及MMP-9蛋白相對表達量均顯著下調,差異具有統計學意義(P<0.05),miR-NC+EMT組各蛋白表達均未發生顯著變化(P>0.05);與miR-876-5p+EMT組比較,miR-876-5p+EMT+ISO組E-cadherin蛋白相對表達量顯著下調,同時Vimentin、N-cadherin、Snail、MMP-2及MMP-9蛋白相對表達量均顯著上調,差異具有統計學意義(P<0.05),見圖3。

圖3 各組胃癌細胞上皮-間質轉化相關蛋白表達水平比較注:1為對照組,2為EMT組,3為miR-NC+EMT組,4為miR-876-5p+EMT組,5為miR-876-5p+EMT+ISO組。與對照組比較,*P<0.05;與EMT組比較,#P<0.05;與miR-876-5p+EMT組比較,^P<0.05

2.3各組胃癌細胞增殖水平比較:CCK-8檢測結果顯示,在24、48、72h時,EMT組胃癌細胞增殖活性顯著高于對照組,差異具有統計學意義(P<0.05);與EMT組比較,miR-876-5p+EMT組細胞增殖活性顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05),miR-NC+EMT組則未發生顯著變化(P>0.05);miR-876-5p+EMT+ISO組細胞增殖活性顯著高于miR-876-5p+EMT組,差異具有統計學意義(P<0.05),見圖4。

圖4 各組胃癌細胞增殖活性比較

EdU染色結果顯示,EMT組胃癌細胞EdU陽性率顯著高于對照組,差異具有統計學意義(P<0.05);miR-876-5p+EMT組EdU陽性率顯著低于EMT組,差異具有統計學意義(P<0.05),miR-NC+EMT組與EMT組的EdU陽性率差異未有統計學意義(P>0.05);miR-876-5p+EMT+ISO組EdU陽性率顯著高于miR-876-5p+EMT組,差異具有統計學意義(P<0.05),見圖5。

圖5 各組胃癌細胞增殖水平比較(EdU染色,×100)注:與對照組比較,*P<0.05;與EMT組比較,#P<0.05;與miR-876-5p+EMT組比較,^P<0.05

2.4各組細胞遷移與侵襲能力比較:Transwell小室測定結果顯示,與對照組比較,EMT組胃癌細胞遷移數目與侵襲數目顯著增加,差異具有統計學意義(P<0.05);與EMT組比較,miR-876-5p+EMT組遷移數目與侵襲數目顯著減少,差異具有統計學意義(P<0.05),miR-NC+EMT組遷移數目與侵襲數目均未發生顯著變化(P>0.05);與miR-876-5p+EMT組比較,miR-876-5p+EMT+ISO組遷移數目與侵襲數目顯著增加,差異具有統計學意義(P<0.05),見圖6。

圖6 各組胃癌細胞遷移與侵襲變化比較(結晶紫染色,×100)注:與對照組比較,*P<0.05;與EMT組比較,#P<0.05;與miR-876-5p+EMT組比較,^P<0.05

2.5各組細胞TGF-β1介導的ERK信號通路相關蛋白表達比較:經Western blot檢測發現,與對照組比較,EMT組胃癌細胞中p-ERK1/2蛋白相對表達量顯著上調,差異具有統計學意義(P<0.05);與EMT組比較,miR-876-5p+EMT組p-ERK1/2蛋白相對表達量顯著下調,差異具有統計學意義(P<0.05);與miR-876-5p+EMT組比較,miR-876-5p+EMT+ISO組p-ERK1/2蛋白相對表達量則顯著上調,差異具有統計學意義(P<0.05)。此外,各組細胞中ERK1/2蛋白相對表達量之間差異無統計學意義(P>0.05),見圖7。

圖7 各組胃癌細胞ERK信號通路相關蛋白表達比較注:1為對照組,2為EMT組,3為miR-NC+EMT組,4為miR-876-5p+EMT組,5為miR-876-5p+EMT+ISO組。與對照組比較,*P<0.05;與EMT組比較,#P<0.05;與miR-876-5p+EMT組比較,^P<0.05

3 討 論

目前,已在胃癌中發現了多種異常表達的miRNA,miRNA可作為腫瘤抑制因子或腫瘤促進因子發揮作用。miRNA-149在胃癌組織和細胞中表達降低,將其過表達能夠促進細胞凋亡,延緩細胞周期,并抑制胃癌細胞系AGS和MKN28的增殖和遷移; miR-181a-2-3p在尺寸較大(≥5cm)的胃癌組織、T分期較高以及化療耐藥細胞中表達升高,可作為預測胃癌患者總生存期的有效生物標志物,而抑制miR-181a-2-3p表達能夠增加順鉑誘導下胃癌細胞的凋亡[7]。由此可見,miRNA不僅可以用作胃癌診斷的生物標志物,還可以作為潛在的治療靶點,在臨床上具有很廣的應用前景。深入探究miRNA在胃癌中的作用及具體機制,對于延長胃癌患者生存期及改善預后意義重大。

胃癌的發生和發展與EMT的激活相關。間充質細胞傾向于去分化,以獲得致瘤性和干細胞表型,導致細胞粘附能力的喪失,從而誘導細胞侵襲和轉移。EMT中上皮細胞向間充質細胞的轉化可以通過相關蛋白標志物表達變化來反映,即在腫瘤EMT過程中,腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力,導致上皮細胞標志物E-cadherin表達下調,間充質細胞標志物Vimentin和N-cadherin表達上調[8]。當受到腫瘤微環境中不同信號分子的刺激,如缺氧、炎癥因子和生長因子作用,胃癌細胞激活相關信號通路并刺激下游轉錄因子參與EMT過程,從而影響相關生物學特征如遷移和侵襲。TGF-β1是一種具有多種生物活性的細胞因子,在腫瘤進展階段,由惡性上皮性腫瘤細胞和基質細胞分泌出來后,誘導并促進腫瘤細胞的EMT過程,進而加速腫瘤的浸潤與擴散[9]。本研究結果顯示,經過TGF-β1誘導胃癌細胞后,E-cadherin熒光表達減弱,Vimentin和N-cadherin熒光表達增強,細胞中E-cadherin蛋白相對表達量下調,Vimentin、N-cadherin、Snail、MMP-2及MMP-9蛋白相對表達量均上調,該結果說明TGF-β1成功誘導了胃癌細胞EMT過程。MMP是與腫瘤發生緊密相關的蛋白酶家族,作為一類鋅依賴性內肽酶家族,MMP通過降解基底膜和細胞外基質促進轉移環境中腫瘤細胞的侵襲和增殖,MMP-2和MMP-9是MMP家族的兩個重要成員,在EMT過程中均上調表達,進而介導腫瘤的侵襲轉移[10]。

越來越多的研究表明,miR-876-5p在多種腫瘤中發揮重要作用,Xie等[11]研究發現miR-876-5p在骨肉瘤組織中表達下調,其過表達能夠通過靶向細胞間質上皮轉換因子(cellular-mesenchymal epithelial transition factor,c-Met)來抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移及侵襲;Li等[12]研究表明miR-876-5p通過靶向G蛋白亞基γ12(G protein subunit gamma 12,GNG12)抑制膠質瘤細胞增殖、遷移,并抑制磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號傳導活性減緩膠質瘤的惡性發展;本研究結果顯示,相較于TGF-β1單獨誘導胃癌細胞,轉染miR-876-5p后再經TGF-β1誘導的胃癌細胞,不僅E-cadherin表達升高,Vimentin、N-cadherin、Snail、MMP-2及MMP-9表達下降,而且細胞增殖能力下降,細胞遷移數目與侵襲數目也減少,由此推測,miR-876-5p能夠抑制TGF-β1介導的EMT進程從而降低胃癌細胞增殖、遷移及侵襲能力,以此發揮抗腫瘤作用。

ERK途徑屬于絲裂原活化蛋白激酶家族,在級聯信號傳導中發揮重要作用,其激活后通過磷酸化調節各種轉錄因子的活性,從而調節細胞的新陳代謝和功能,影響細胞的特定生物學效應。ERK途徑的功能障礙是大多數癌癥發展的主要觸發因素,其級聯反應的激活發生在包括胃癌在內的大多數癌癥類型中,并已在胃癌腫瘤中檢測到ERK表達升高[13]。此外,ERK途徑和胃癌細胞EMT過程密切相關,已有研究表明,纖維連接蛋白-C可通過抑制ERK磷酸化水平降低胃癌EMT能力,最終抑制胃癌細胞的增殖和遷移水平[14]。由此可見,靶向抑制ERK途徑激活可能在胃癌治療中具有廣闊的前景。本研究結果顯示,在TGF-β1誘導胃癌細胞EMT后,細胞中p-ERK1/2蛋白表達明顯上調,表明ERK途徑激活,而轉染miR-876-5p后再經TGF-β1誘導的胃癌細胞中p-ERK1/2蛋白表達受到抑制,根據該結果推測,miR-876-5p抑制胃癌細胞EMT過程可能與抑制ERK途徑的激活有關。

綜上,本研究檢測到miR-876-5p在胃癌組織中低表達,探索了其能夠顯著抑制TGF-β1誘導的胃癌細胞EMT,并抑制胃癌細胞增殖、遷移及侵襲,從而發揮了抗腫瘤作用,其機制可能與調控ERK途徑有關,這為揭示胃癌轉移的潛在分子機制提供了理論依據,并為研究胃癌侵襲轉移的預防策略及靶向治療提供了新思路。