中國人群外周血RABL6基因甲基化與早期肺癌的關聯性研究

黃海霞,喬 榮,李夢夏,顧萬建,韓寶惠,楊蓉西

2020年全球癌癥數據顯示,肺癌(lung cancer,LC)死亡人數位居第一[1-2]。中國LC死亡人數占全球的42%[3]。LC治療的結局和預后與其初始診斷分期密切關聯。據報道[4],I期患者的5年生存率為83%,IV期僅為6%。目前,低劑量計算機斷層掃描(low-dose computed tomography,LDCT)篩查是降低LC死亡率的有效方式[5]。使用LDCT對高危人群進行篩查可使特異性病死率降低20%,總病死率降低3.2%[5]。然而,其存在假陽性過高、輻射傷害和成本效益低[5-6]等諸多不足。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳修飾[7],也是癌癥發展的早期事件和伴隨事件,可應用于癌癥早篩。早期LC,在臨床上通常是指Ⅰ期,包括ⅠA期和ⅠB期。課題組前期研究[8-9]也表明,外周血中PNPLA2和FYB等甲基化的改變與早期LC相關。該研究旨在調查RABL6甲基化改變與早期LC之間的關系,評估其作為生物標志物的可能性,為開發基于外周血DNA甲基化來評估早期LC風險的潛在標志物提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 病例資料該研究收集了2018—2019年在上海胸科醫院確診的LC患者275例,年齡29～80 (55.29±10.62)歲,其中男性136例(49.5%),女性139例(50.5%),Ⅰ期224例(81.5%)。病例納入標準:經病理科和胸外科共同診斷為LC、有完整的臨床數據記錄、尚未開始放療或化療、無其他癌癥病史且無來自其他器官的癌癥轉移。收集LC患者臨床信息,包括腫瘤類型、大小、長度、分期和淋巴結受累情況等。見表1。

表1 LC病例的基本臨床特征

根據LC患者的年齡性別特征,在上海胸科醫院篩選同期診斷為良性結節的患者185例,年齡25～80 (54.77±10.22)歲,其中男性84例(45.4%),女性101例(54.6%)。良性對照納入標準:經病理診斷為良性肺結節、有完整的臨床數據記錄且無其他癌癥病史等。此外,在江蘇省中醫院體檢中心篩選與LC患者年齡和性別相匹配的健康對照267例,年齡23～80(54.58±10.89)歲,男性132例(49.4%),女性135例(50.6%)。對照納入標準:所有對照通過胸部X光片檢查均為陰性并自述健康、無任何癌癥病史或自身免疫性疾病等。該研究方案獲得上海市胸科醫院和江蘇省中醫院倫理委員會批準(編號:KS1407)。所有研究對象均簽署書面知情同意書。

1.2 樣品采集與處理對于LC患者和良性肺結節對照,在進行手術和相關治療前收集血液樣本。使用含EDTA的采血管收集研究對象外周血,并保存于-80 ℃。應用南京騰辰生物科技有限公司的DNA提取試劑盒提取全基因組DNA。

使用DNA甲基化檢測樣本前處理試劑盒,對DNA進行重亞硫酸氫鹽處理。這一過程將未甲基化CpG位點的胞嘧啶轉化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變。

1.3 基因甲基化水平測定使用EpiDesigner進行引物設計,引物擴增片段大小為298 bp,位于RABL6的第二內含子區(Chr9:139719815-139720112),共包含17個CpG位點,見圖1。引物序列上無CpG位點與已知的單核苷酸多態性重合。根據Yang et al[10]的描述,采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS,美國Agena Bioscience公司)對基因甲基化水平進行定量檢測。對重亞硫酸氫鹽處理后的DNA進行PCR擴增。采用蝦堿性磷酸酶處理PCR產物,隨后用Rnase A進行切割,并用樹脂進一步清洗。通過Nanodispenser將產物轉移到384 SpectroCHIP中進行檢測。數據由SpectroACQUIRE 3.3.1.3軟件收集,使用MassArrayEpiTyper 1.2進行可視化處理。由于亞硫酸氫鹽處理后未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶,因此甲基化和非甲基化DNA會產生不同的切割產物。MassArray儀器能夠定量檢測甲基化與未甲基化DNA 的比例。其中,RABL6_CpG_1、RABL6_CpG_6.7.8、RABL6_CpG_11.12.13和RABL6_CpG_14.15.16位點因信號質量峰過低或過高無法檢測而被排除。

圖1 RABL6基因擴增片段示意圖、序列和信號峰

1.4 統計學處理采用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析。根據MALDI-TOF-MS檢測原理,該研究中測出來的甲基化值的范圍是0～1(即0%～100%),多數學者采用每10%的變化來評估甲基化與結局事件的關聯,如Yang et al[10],因此該研究也采用該方式評估RABL6基因甲基化水平每改變10%與早期LC的關聯。所有樣本使用隨機數法排版,將2塊384孔板分別編碼為1和2。使用無序多分類Logistic回歸分析DNA甲基化水平與LC之間的關聯,將LC患者設置為參照組,校正年齡、性別和實驗批次后,計算RABL6甲基化水平每減少10%的OR和 95%CI。Mann-WhitneyU檢驗用于分析不同臨床特征分組間的甲基化水平差異。所有統計分析均采用雙側檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血RABL6甲基化與LC之間的相關性在275例LC患者、185例良性對照和267例健康對照中,本研究共檢測了RABL6基因7個CpG位點的甲基化水平。經校正協變量(年齡、性別和實驗批次)的無序多分類Logistic回歸分析,在LC患者vs健康對照以及在LC患者vs良性對照中,均未觀察到上述RABL6的7個CpG位點甲基化水平與LC之間存在關聯 (P>0.05)。見表2。

表2 RABL6甲基化與LC之間的關聯

2.2 對患者按性別和年齡分層后分析RABL6甲基化與LC之間的相關性性別、年齡與基因的甲基化的改變有關。為此,本研究對受試者按照性別和年齡分層后,進一步觀察RABL6甲基化水平與LC之間的相關性。性別分層后,LC患者vs健康對照中,RABL6_CpG_17甲基化的改變均與LC顯著相關,在不同性別中呈現相反的趨勢。在女性LC患者中,RABL6_CpG_17的甲基化水平與LC呈負相關,即甲基化水平每減少10%,LC的風險增加1.47倍(OR=2.47,95%CI=1.19～5.13,P=0.016),提示RABL6_CpG_17的甲基化水平升高對于女性可能是保護性因素;而在男性中,RABL6_CpG_17的甲基化水平與LC呈正相關(甲基化水平每減少10%,OR=0.52,95%CI=0.29～0.94,P=0.030),提示RABL6_CpG_17的甲基化水平降低對于男性可能是保護性因素。其余6個CpG位點均未顯示出與LC有關聯(P>0.05)。而在LC患者vs良性對照中,7個CpG位點的甲基化水平在性別分組中均未顯示與LC相關 (P>0.05)。對以上所有P值進行FDR校正后,統計學差異消失。見表3。

表3 性別分層分析RABL6甲基化與LC之間的關聯

隨后,以中位年齡55歲為界對研究對象進行年齡分層分析。在LC患者vs健康對照中,年齡>55歲患者中RABL6_CpG_2位點的高甲基化與LC相關,即甲基化水平每減少10%(OR=0.77,95%CI=0.60～ 0.99,P=0.038);而在年齡≤55歲的人群中,未發現RABL6甲基化與LC的關聯性(P>0.05)。LC患者vs良性對照中,同樣在年齡>55歲患者中觀察到RABL6_CpG_5位點的甲基化與LC呈正相關,即甲基化水平每減少10% (OR=0.58,95%CI=0.34～0.97,P=0.038)。在年齡≤55歲分組中未觀察到其他CpG位點與LC相關 (P>0.05)。對以上所有P值進行FDR校正后,差異無統計學意義。見表4。

表4 年齡分層分析RABL6甲基化與LC之間的關聯

2.3 RABL6甲基化與LC臨床特征之間的相關性為了解RABL6甲基化水平與LC臨床特征之間的相關性,采用Mann-WhitneyU檢驗比較不同臨床特征分組之間RABL6甲基化水平差異。與腫瘤較小(腫瘤長度≤1.5 cm)的患者比較,腫瘤長度>1.5 cm的LC患者RABL6_CpG_17的甲基化水平更高(甲基化的中位數:0.96vs0.97,P=0.026),表明RABL6_CpG_17的高甲基化可能與LC的進展有關。但是其余CpG位點并未顯示出這一趨勢。尚未發現RABL6甲基化水平與腫瘤類型、淋巴結轉移以及腫瘤分期等存在關聯(P>0.05)。見表5。

表5 RABL6甲基化水平與不同臨床特征之間的關聯

3 討論

RABL6(又名PARF、RBEL1、C9orf86)是Ras超家族中一種新型的Rab亞科成員[11],位于9q34.3,由小型GTP酶組成,參與多種癌癥的發生和發展。研究[11-12]表明,RABL6促進食管鱗狀細胞癌和胃癌等多種癌細胞的增殖、侵入和遷移,且癌組織中RABL6的表達與食管鱗狀細胞癌和非小細胞肺癌的總生存期和無病生存期相關[11,13]。

在RABL6多個CpG位點中,本研究僅觀察到RABL6_CpG_17與LC存在顯著關聯,這提示DNA甲基化具有精確調控的特點[14]。而且這一相關性在男性和女性中呈現出相反的趨勢,這可能與男性和女性中各自的性激素及其相關的調控途徑以及生活方式(比如吸煙、飲酒)有關。研究表明,不同性別的LC患者生存期存在差異,女性與較長的LC生存期存在顯著相關[15],在非吸煙LC患者中,女性的比例遠多于男性[16],提示男性和女性中獨特的性激素及其相關調控通路的差異性作用。比如,一些信號通路(如cAMP信號通路和卵巢類固醇生成)在非吸煙人群中特異性富集,一些與雌激素功能和MAPK/PI3K信號相關的蛋白(如KRT16、ERBB4和NTF4)在不吸煙的男性和女性LC進展中表現出不同的影響[16]。也有研究[17]表明,性類固醇可能參與非小細胞肺癌的發生和進展。此外,相較于女性,男性中更常見的吸煙、飲酒等與癌癥等多種疾病的發生相關的生活方式影響甲基化,進而影響癌癥的發生發展,也可能導致在男性和女性中RABL6的不同甲基化狀態與LC相關。

癌癥是一種與衰老相關的疾病。衰老和癌癥具有相似的DNA甲基化改變,包括基因啟動子區域的高甲基化,基因體的廣泛低甲基化,以及其他累積的表觀遺傳缺陷,這可能是DNA甲基化介導的和衰老相關的癌癥的潛在機制[18]。有研究[19]揭示了人類外周血中白細胞的DNA甲基化水平可能隨年齡變化而變化。本研究僅在年齡>55歲的研究對象中觀察到RABL6_CpG_2、 RABL6_CpG_5位點的高甲基化與LC之間存在關聯,這表明外周血中某些基因的DNA甲基化改變可能是老年人患LC的一種風險。

本研究基于500多例樣本的分析,結果顯示RABL6基因甲基化在LC患者、良性結節對照和健康對照中存在差異,這為開發基于外周血DNA甲基化評估早期LC風險的潛在標志物提供了新的線索。目前外周血甲基化改變與LC早篩早診的研究較多,多個基因DNA甲基化改變聯合或結合現有診斷技術(如LDCT)應用往往能獲得更高的應用價值[20]。因此,隨著研究內容的豐富,外周血DNA甲基化有望能為早期LC篩查提供更準確可靠的預測價值。但本文是回顧性且單中心研究,樣本的選擇可能存在一定的偏倚,而且在收集樣本信息時,缺失家族史等暴露信息,在后續的研究中,將通過前瞻性大樣本多中心的研究,驗證相關的結果,并通過功能實驗進一步觀察RABL6相關的分子機制。綜上所述,該研究表明外周血DNA甲基化可以作為一種新的診斷方法,有望成為精確診斷LC的早期指標。