草地貪夜蛾體表靶向TRPV1的毒素分子篩選及其功能研究

劉嘉逸　張浩源　馮雯靈　賈佩君　加依達古麗·格明　尹傳玲　柴龍會　陸先翠　王云飛　馬志朋

摘要［目的］探究草地貪夜蛾誘發(fā)人畜危害的分子機制，以草地貪夜蛾誘發(fā)人畜呼吸道炎癥、疼痛等危害的潛在生理靶點（瞬時電位感受器香草酸受體1，TRPV1）為切入點，揭示草地貪夜蛾體表物質(zhì)誘發(fā)人畜危害的毒素物質(zhì)基礎和生理靶點。［方法］通過凝膠分子篩以及高效液相色譜等方法對草地貪夜蛾體表物質(zhì)進行分離和純化，結(jié)合膜片鉗電生理技術篩選草地貪夜蛾體表物質(zhì)中靶向TRPV1的活性毒素組分。［結(jié)果］從草地貪夜蛾體表物質(zhì)中分離純化到一種能夠高效（100 mg/L）激活TRPV1的毒素組分V-7，該組分能特異性作用于TRPV1，而對常見離子通道類膜蛋白生理受體（如鈉離子通道NaV1.4、NaV1.5、NaV1.7，以及鉀離子通道KV1.1、KV2.1、KV4.1）沒有作用。［結(jié)論］從草地貪夜蛾體表混合物中可分離得到一種高效且特異性激活動物生理靶點TRPV1的毒素組分，部分揭示了外來入侵農(nóng)業(yè)害蟲草地貪夜蛾誘發(fā)人畜危害的物質(zhì)基礎及生理靶點。

關鍵詞草地貪夜蛾；體表物質(zhì)；TRPV1；毒素

中圖分類號S433.4文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）11-0065-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.015開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Molecular Screening and Functional Investigation of Toxins Targeted to TRPV1 in the Body Surface of Spodoptera frugiperda

LIU Jia-yi，ZHANG Hao-yuan，F(xiàn)ENG Wen-ling et al（College of Wildlife and Nature Reserves， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract［Objective］In order to explore the molecular mechanism of human-animal hazards induced by the fall armyworm， the potential physiological targets （transient receptor potential vanillic acid subtype 1， TRPV1） inducing human and animal respiratory inflammation and pain were used as the entry point， and the toxin material basis and physiological targets of the body surface substance of Spodoptera frugiperda were used as the entry point to reveal the toxin substance basis and physiological target of the human and animal hazards induced by the material on the surface of Spodoptera frugiperda. ［Method］The body surface substance of the grass moth was isolated and purified by gel molecular sieve and high performance liquid chromatography， and the active toxin components targeting TRPV1 in the body surface sunstance of the grass night moth were screened by combining patch clamp electrophysiology technology. ［Result］A toxin component V-7 that can efficiently （100 mg/L） activate TRPV1 was isolated and purified from the body surface substance of the grassland nightcrawler， which can act specifically on TRPV1， but has no effect on common ion channel membrane protein physiological receptors （such as sodium channel Nav1.4， Nav1.5， Nav1.7， and potassium channel Kv1.1， Kv2.1， Kv4.1）. ［Conclusion］It is shown that a toxin component that efficiently and specifically activates the animal physiological target TRPV1 can be isolated from the body surface substance of Spodoptera frugiperda， which partially reveals the material basis and physiological target of the human and animal hazards induced by the invasive invasion of Spodoptera frugiperda in agriculture and forestry.

Key wordsSpodoptera frugiperda;Body surface substance;TRPV1;Toxin

鱗翅目害蟲在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中危害嚴重，對于生態(tài)系統(tǒng)、人類生產(chǎn)以及健康等方面都會造成影響，而外來入侵物種由于更強的競爭能力和缺乏天敵等原因會加劇上述危害的程度［1］。草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是一種對農(nóng)業(yè)危害嚴重的外來入侵物種，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向全球發(fā)出預警的重大遷飛性害蟲，具有雜食暴食性、遷飛速度快、繁衍能力強、辨別困難等特點［2］，嚴重影響我國作物產(chǎn)量，破壞當?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)結(jié)構與功能，影響農(nóng)業(yè)發(fā)展，威脅國家農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與糧食安全與人畜健康［3］。截至2019年8月17日，草地貪夜蛾在我國24個省份1 366個縣（市、區(qū)）分布，隨著其分布范圍不斷擴大，在危害玉米等作物的同時，其與人畜接觸的概率也大大增加［4-7］。研究表明，草地貪夜蛾的接觸會導致人畜產(chǎn)生呼吸道炎癥、疼痛等不良反應［8］，但草地貪夜蛾通過何種毒素物質(zhì)作用于人類尚鮮見報道，相應的生理靶點尚未被揭示，同時毒素物質(zhì)與相應生理靶點的互作分子機制仍未被探明［9-11］。由此，探明農(nóng)業(yè)害蟲草地貪夜蛾導致人畜危害的毒素物質(zhì)基礎和生理靶點，可以闡明草地貪夜蛾導致人畜危害的分子機制，也可以為草地貪夜蛾誘發(fā)人畜危害的科學防治提供理論基礎。

瞬時電位感受器香草酸受體1（transient receptor potential vanillic acid subtype 1，TRPV1），又稱辣椒素受體，是一種非選擇性陽離子通道，廣泛分布于哺乳動物的皮膚、呼吸道等器官的神經(jīng)末梢中，與環(huán)境溫度感知、疼痛信號傳遞、炎癥和免疫激活、咳嗽引發(fā)等生理活動相關［12-15］。其特異性激活劑香草酸類似物等刺激性物質(zhì)可引起動物產(chǎn)生疼痛、咳嗽、神經(jīng)源性炎癥等癥狀，這些不良反應與接觸飛蛾引起的呼吸道炎癥、疼痛等癥狀類似［16-18］。同時，有研究表明，動物接觸草地貪夜蛾的主要成分為其體表的物質(zhì)（如鱗粉等）［8］。因此，筆者推測草地貪夜蛾體表物質(zhì)中可能含有可以激活TRPV1的毒素物質(zhì)成分。這些物質(zhì)中的相應毒素物質(zhì)通過特異性靶向TRPV1，導致人畜接觸草地貪夜蛾后產(chǎn)生呼吸道炎癥等癥狀。筆者利用蛋白純化、高效液相色譜等技術對草地貪夜蛾體表物質(zhì)進行了分離和純化，并利用膜片鉗電生理以及微量藥物灌流等技術進行了功能篩選研究。通過這些研究，從草地貪夜蛾體表物質(zhì)混合物中分離得到一種高效且特異性激活動物生理靶點TRPV1的毒素物質(zhì)，揭示了草地貪夜蛾誘發(fā)人畜危害的部分物質(zhì)基礎及生理靶點。

1材料與方法

1.1材料與儀器將購買的草地貪夜蛾蛹放置室內(nèi)飼養(yǎng)7 d［T=（25±1） ℃，L∶D=12∶12 h，RH=（75±5）%］，待其羽化后，采集成蟲翅膀與體表物質(zhì)，液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱中。

試驗試劑：PBS（18 g/L NaCl、0.20 g/L KCl、1.44 g/L Na₂HPO₄、0.24 g/L KH₂PO₄，HCl調(diào)至pH=6），Sephadex G-50凝膠（Amersham Biosciences）、乙腈（Thermo）、DMEM細胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清、Lipofectamine 2000、OptiMEM培養(yǎng)基、電生理試驗所使用的試劑均購于Thermo公司，質(zhì)粒小提中量試劑盒購于生工生物工程（上海）有限公司，KOH、HEPES、氯化膽堿、D-glucose、MgCl₂、CaCl₂、KOH均購于Sigma公司，所有試驗用水均為超純水。

試驗儀器：生物安全柜（ESCO，日本）；-80 ℃超低溫冰箱（Panasonic，日本）；高效液相色譜儀（Waters 1525，美國）；蛋白純化系統(tǒng)（AKTA pure，中國）；電子天平（Sartorins TE124S）；臺式離心機（Eppendorf Centrifuge 5424）；冷凍臺式離心機（Sigma 3-18K、Scan Spend 1730R）；紫外分光光度計（UNICO）；電子脈沖刺激儀（LGT-2300S）；質(zhì)譜儀（MALDI-TOF，Bio）；C18柱（30.0 mm×4.6 mm，Aglient）；凝膠過濾層析玻璃柱（北京瑞達恒輝公司）；冷凍干燥機（Thermo）；移液器（Eppendorf）；超純水儀（Synergy，愛爾蘭）；高壓蒸汽滅菌鍋（Zealway）；pH計（Thermo）；電子分析天平（Sartovius）；膜片鉗系統(tǒng)（HEKA）；電機控制儀（PC-50，Narishige）；灌流裝置（Biorep Perfusion Apparatus）。

試驗所用人胚腎細胞（HEK293T）由實驗室保存并傳代培養(yǎng)；試驗用質(zhì)粒由實驗室提供并保存。

1.2葡聚糖凝膠Sephadex G-50分離

1.2.1凝膠裝填。55 g Sephadex G-50用1.1 L的PBS溶液混勻，100 ℃水浴1～2 h后，置于真空抽制器中3～4 h；緩慢向凝膠柱中一次性加入凝膠后，設置蛋白純化儀流速0.3 mL/min，待凝膠穩(wěn)定在指定位置后，卸下裝柱器，設置PBS溶液流速為0.3 mL/min，過夜灌流。

1.2.2樣品預處理。取適量樣品于5 mL 4 ℃冰箱預冷的PBS溶液中溶解，離心（12 000 r/min，4 ℃，10 min），吸取上清液，0.22 μm針孔式微孔濾膜過濾，置于冰上備用。

1.2.3上樣。用5 mL注射器吸取樣品，通過蛋白純化儀上樣口，每次緩慢推入1 mL樣品。

1.2.4洗脫與收集。設置流速為1 mL/min，樣品洗脫液收集在干凈玻璃管中，洗脫產(chǎn)物按波長215 nm和280 nm光吸收值峰值位置的不同將洗脫液合并，冷凍干燥機凍干備用。

1.3高效液相色譜分離無機相：超純水。有機相：乙腈。樣品預處理：超純水以400 mg/mL溶解待分離樣品，0.22 μm針孔式微孔濾膜過濾，置于冰上備用。上樣：5 mL注射器吸取樣品，通過高效液相色譜儀上樣口，緩慢加入1 mL樣本。洗脫與收集：設置流速1 mL/min，無機相沖洗10 min后，有機相以2%/min梯度洗脫，洗脫液收集于干凈玻璃管中，洗脫產(chǎn)物按波長215 nm和280 nm光吸收值峰值位置不同進行合并，冷凍干燥機凍干備用。

1.4轉(zhuǎn)染HEK293T細胞

1.4.1細胞培養(yǎng)。吸取HEK293T細胞（密度80%～90%）200 μL于35 mm細胞培養(yǎng)皿中，加入2 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱37 ℃ 5%? CO₂培養(yǎng)12～16 h。

1.4.2細胞轉(zhuǎn)染。吸去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，沿內(nèi)壁緩慢加入2 mL Opti-MEM細胞培養(yǎng)液。準備1.5 mL離心管2個，A管：200 μL Opti-MEM細胞培養(yǎng)液，6 μL Lipofectamine 2 000；B管：200 μL Opti-MEM細胞培養(yǎng)液，5 μg質(zhì)粒，1 μg EGFP熒光標簽；室溫靜置5 min后，將A管加入B管中混勻，室溫靜置15 min，均勻滴加到細胞培養(yǎng)皿，置于37 ℃ 5% CO₂培養(yǎng)箱中4 h，吸去細胞培養(yǎng)皿中Opti-MEM細胞培養(yǎng)液，加入2 mL DMEM+10%血清細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至次日。

1.5膜片鉗功能驗證依次連接灌流器、三通閥、橡膠軟管、導管、電極，超純水檢漏，浴液沖洗后安裝到微操工作臺上。五步拉制法制備硼硅酸鹽玻璃微電極（505 ℃、速度19），電極阻抗為 3～5 MΩ，高溫拋光后置于電極盒中備用。已轉(zhuǎn)染細胞用1 mL胰蛋白酶消化1 min，吸去消化液，加入2 mL含10% FBS的 DMEM細胞培養(yǎng)液終止消化，吹打重懸，滴加到鋪在35 mm細胞培養(yǎng)皿底部的細胞爬片上，培養(yǎng)箱中靜置30 min，待細胞貼附。使用EPC-9膜片鉗放大器（HEKA公司，德國）進行試驗記錄。在電極與細胞膜形成高阻（1～5 GΩ）封接后，-80 mV電壓鉗制將膜吸破，形成全細胞狀態(tài)進行電流記錄。待測樣本采用對應通道的電極浴液配制，通過切換電極給藥，排藥管每個管口直徑 0.5 mm，管口距所記錄的細胞<100 μm。在成功封接破膜形成全細胞膜片鉗記錄模式后，通過rsc-200灌流加藥系統(tǒng)切換灌流管。試驗在室溫（22～26 ℃）進行。

2結(jié)果與分析

2.1草地貪夜蛾體表物質(zhì)葡聚糖凝膠分離首先對草地貪夜蛾體表物質(zhì)進行葡聚糖凝膠分離，經(jīng)進樣試驗，最終確定使用280 nm吸收值對樣品進行檢測，每次進樣5 mL，流速1.0 mL/min時，樣品有較好的分離效果。草地貪夜蛾體表物質(zhì)粗樣經(jīng)葡聚糖凝膠分子篩按照物質(zhì)分子量大小進行分離后，較大的組分較早洗脫出峰，較小的組分較晚洗脫出峰。分離完畢后280 nm光吸收值峰如圖1所示，上樣洗脫38 min后開始出峰，可分為5個分離效果較好的峰，且各峰對稱性良好，將其按照洗脫的先后順序分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，其中Ⅴ峰含量最為豐富。

2.2膜片鉗功能驗證對粗樣中分離出的組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ以400 mg/L的濃度溶于TRP離子通道細胞外液中，使用全細胞電壓鉗模式在表達TRPV1蛋白的HEK293T細胞上進行膜片鉗記錄。細胞鉗制于0 mⅤ，之后外加+80 mV電壓刺激300 ms，再外加-80 mV電壓刺激300 ms。通過試驗發(fā)現(xiàn)，組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ對TRPV1離子通道無明顯的激活或抑制作用，而組分Ⅴ對TRPV1通道具有顯著的激活作用，膜片鉗試驗電流如圖2所示。這提示在組分Ⅴ中具有可以靶向作用于TRPV1的毒素物質(zhì)成分，因此下一步試驗中，筆者對組分Ⅴ進行了進一步的分離純化。

2.3組分Ⅴ高效液相色譜分離純化利用C18色譜柱對組分Ⅴ進行反向高效液相色譜（RP-HPLC）分離純化，結(jié)果如圖3所示。前10 min使用超純水洗脫，防止乙腈使樣品內(nèi)的鹽類在色譜柱內(nèi)析出而降低柱效。10 min后，樣本與柱內(nèi)填料充分結(jié)合，且鹽類成分洗脫完畢，乙腈濃度以2%/min梯度增加，持續(xù)80 min，在56 min內(nèi)樣品完全洗脫。各組分光吸收值積分面積統(tǒng)計見表1，按照出峰時間進行編號。

2.4組分V-7激活TRPV1離子通道從組分V分離出的所有成分以100 mg/L溶于TRP離子通道細胞外液中，使用全細胞電壓鉗模式在表達TRPV1的HEK293T細胞上進行膜片鉗記錄。細胞鉗制于0 mV之后外加+80 mV電壓刺激300 ms，再外加300 ms的-80 mV電壓刺激。TRPV1的膜片鉗試驗電流如圖4所示。V-7（圖4）使TRPV1通道開放，產(chǎn)生了明顯的激活現(xiàn)象，其余16個組分均不能激活TRPV1。

2.5組分V-7的功能特異性為確定V-7對TRPV1的特異性，探索V-7對于常見的鉀離子通道家族與鈉離子通道家族的作用，選取6種常見的離子通道進行了探究。分別為：廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)元動作電位的復極化過程中起著決定作用的KV1.1（電壓敏感性鉀離子通道1.1）；廣泛表達于心肌細胞，使心肌動作電位復極的主要離子通道KV2.1（電壓敏感性鉀離子通道2.1）；主要分布于腦中，同樣在神經(jīng)元動作電位的復極化過程中起著重要作用的KV4.1（電壓敏感性鉀離子通道4.1）；主要分布于骨骼肌細胞中，與肌肉收縮有關的NaV1.4（電壓敏感性鈉離子通道1.4）；主要分布于心肌中，負責心肌細胞動作電位形成及沖動傳導的NaV1.5（電壓敏感性鈉離子通道1.5）；主要分布在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，在機體感覺尤其是疼痛的感覺及傳導中起重要作用的NaV1.7（電壓敏感性鈉離子通道1.7）。

V-7以100 mg/L的濃度溶于鉀離子通道細胞外液中進行藥物灌流，使用全細胞電壓鉗模式在表達通道的HEK293T細胞上進行膜片鉗記錄。細胞鉗制于-80 mV，之后外加+10 mV電壓刺激600 ms。對小鼠鉀離子通道KV1.1、KV2.1、KV4.1的膜片鉗試驗電流圖如圖5所示，結(jié)果表明，V-7對常見的電壓敏感型鉀離子通道KV1.1、KV2.1、KV4.1均無明顯作用。

V-7以100 mg/L的濃度溶于鈉離子通道細胞外液中進行灌流研究，使用全細胞電壓鉗模式在表達通道的HEK293T細胞上進行膜片鉗記錄。細胞鉗制于-80 mV，之后外加-10 mV電壓刺激600 ms。對小鼠鈉離子通道NaV1.4、NaV1.5、NaV1.7的膜片鉗試驗電流圖如圖6所示。結(jié)果表明，V-7對常見的電壓敏感型鈉離子通道NaV1.4、NaV1.5、NaV1.7均無明顯作用。

3討論與結(jié)論

草地貪夜蛾具有適應性高、繁殖力強、遷移快和抗藥性高等特點，目前的防治手段有限且效果不明顯［19-20］。在這樣的背景下，草地貪夜蛾入侵的地區(qū)人畜具有高度的暴露風險，也增加了草地貪夜蛾對人畜帶來的健康危害。由于草地貪夜蛾對人畜危害的毒素物質(zhì)基礎和生理靶點尚未被闡明，因此難以揭示草地貪夜蛾導致人畜健康威脅的分子機制，更難以進行草地貪夜蛾的科學防治。

該研究中，通過葡聚糖凝膠分子篩、蛋白純化系統(tǒng)與高效液相色譜分離等多平臺多方法結(jié)合，富集并分離純化了草地貪夜蛾體表物質(zhì)的混合物，建立了一套分離飛蛾體表物質(zhì)中活性物質(zhì)的方法。同時，通過結(jié)合膜片鉗電生理試驗和微量灌流給藥系統(tǒng)，從草地貪夜蛾體表物質(zhì)混合物中分離鑒定到活性組分V-7，其可以高效且特異性地激活TRPV1，而對鈉離子通道如NaV1.4、NaV1.5、NaV1.7，以及鉀離子通道如KV1.1、KV2.1、KV4.1等常見離子通道類膜蛋白生理受體沒有活性功能。這表明草地貪夜蛾體表物質(zhì)中的V-7毒素組分通過高效且特異性的方式激活TRPV1帶來疼痛及炎癥等健康危害［12］，由此部分揭示了草地貪夜蛾對人畜危害的毒素物質(zhì)基礎和生理靶點。

毒素是動物進行捕食、防御甚至競爭的高效物質(zhì)基礎。來源于草地貪夜蛾體表物質(zhì)的毒素物質(zhì)V-7，類似于辣椒、蜈蚣與蝎子所使用的多肽或化合物，可以激活捕食者的TRPV1，由此帶來疼痛、炎癥等一系列中毒的癥狀［21-23］。因此，V-7可以保護草地貪夜蛾免于被捕食，而這些生理反應可能是草地貪夜蛾進化出V-7組分的生態(tài)學作用，而這種生存適應策略，也導致了其對人畜的潛在危害。在日常生活以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動中，若人畜在接觸草地貪夜蛾后不慎吸入其體表物質(zhì)，其中的活性組分V-7將通過激活呼吸道神經(jīng)細胞上的TRPV1［10-11］，引起鈣離子和鈉離子等內(nèi)流，使神經(jīng)元去極化并產(chǎn)生神經(jīng)沖動，同時，釋放多種神經(jīng)肽，進一步引起組織水腫和氣道平滑肌收縮，最終導致咳嗽、炎癥以及哮喘等不良反應［13，16，24-28］。

該研究中，筆者通過毒素物質(zhì)的分離和膜片鉗功能篩選，從草地貪夜蛾體表物質(zhì)混合物中分離鑒定了活性組分V-7，其可以高效且特異性地激活TRPV1。一方面，V-7是草地貪夜蛾進行生存適應的物質(zhì)基礎；另一方面，它也是草地貪夜蛾導致人畜危害的部分毒素物質(zhì)基礎。該研究闡明了草地貪夜蛾導致人畜危害的部分物質(zhì)基礎和生理靶點，同時，在未來研究中可以在分子層面繼續(xù)探究其與TRPV1的互作分子機制，為相關治療藥物的研發(fā)提供理論基礎［29-31］。

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