微流控技術在化妝品安全與功效評價中的應用

葉潔忺 張靜 張子霖 沙利烽 葛健軍 陳早早 張娟 顧忠澤

關鍵詞：化妝品；微流控技術；生物傳感器；皮膚芯片；安全性；功效性

01前言

隨著科技的發展以及人們對化妝品需求的增加，成分更復雜、功能更多樣化的化妝品應運而生，檢驗化妝品安全性、功效性的重要性不言而喻。歐盟消費者安全科學委員會（SCCS） 在《化妝品成分測試及其安全性評估指南注釋》中提出了化妝品成分和產品的安全性評估，要求包括急性毒性、腐蝕和刺激、皮膚致敏、皮膚吸收、慢性毒性等多項研究[1]。

微流控技術是一項綜合性很強的多學科技術，具有在微米尺度上對流體進行精確控制和操縱的能力[2]，與傳統基于實驗室的宏觀技術相比，其優勢在于樣本量小、高通量、低成本、高靈敏度。通過微流控技術與細胞生物學、組織工程技術、生物傳感技術的融合，其在化妝品安全與功效評價中的應用潛力不容忽視。

02理化檢測應用

生物傳感器是一種將生物識別元件和生物材料與物理傳感器結合來轉換生物反應，以產生可測量信號的分析裝置，微流控裝置具有可移動性、操作透明性、可控性、準確性等優點[3，4]。結合微流體技術的生物傳感器可以實現更快的處理和更高的效率，它們在化妝品檢測中發揮著重要作用，如化妝品的有毒元素檢測、活性物質檢測等[5]。

2.1 重金屬檢測

在化妝品中，為了達到美白效果，經常添加汞，一旦過量，就會對皮膚和器官造成慢性毒性[6]。Chao Wu 等人[7] 開發了一種簡單、快速和可視化的Hg2+ 檢測策略。當Hg2+存在時，探針可以轉化為G- 四聯體DNA，并與血紅蛋白結合形成DNA 酶，DNA 酶與沉淀的TMB 反應，在紙上產生可見的色帶，色帶長度與Hg2+ 濃度呈正相關。該傳感器不僅能檢測汞離子，并具有良好的再現性和滿意的動態范圍，檢出限低至0.23 nM。該方法不僅提供了Hg2+ 的可視化快速篩查，而且可應用于其他金屬離子的即時檢測。

2.2 微生物檢測

化妝品微生物指標檢測化妝品微生物污染是社會關注的熱點問題。被污染的微生物可能產生一些代謝物，刺激皮膚炎癥或過敏反應。因此，規范有效的化妝品質量監督管理十分重要[5]。

Peng Zuo 等人[8] 發明了一種聚二甲基硅氧烷（PDMS）/ 紙/ 玻璃混合微流控系統，該系統基于集成的適配體功能化氧化石墨烯生物傳感器，無需樣本制備程序，可直接檢測病原微生物。該微流體生物傳感器裝置只需10 分鐘即可完成金黃色葡萄球菌的檢測，相比于傳統的培養法，大大縮短檢測周期，并且在快速檢測各種不同的其他細菌和病毒病原體方面具有很大的潛力。

2.3 抗生素檢測

化妝品中的抗生素主要有甲硝唑、氯霉素、氧氟沙星等，能抑制皮膚微生物，增強皮膚抵抗細菌感染的能力，達到表面保護皮膚的效果。但長期使用含抗生素的化妝品會引起接觸性皮炎等不良反應，如紅斑、水腫、滲出、灼燒等，還會導致細菌對抗生素的耐藥性增加，降低治療效果[9，10]。

André Kling[11] 等人構建了一個可在臨床相關樣品中同時進行多重分析的電化學檢測的微流控平臺，能實現不同酶聯分析的同時電化學讀數，檢測八種不同的分析物。該裝置可在15 分鐘內使用高靈敏度的生物分子傳感器系統，同時完成樣本中四環素和鏈球菌素這兩種常用抗生素的檢測。

03體外皮膚模型

2019 年，美國環境保護局正式宣布從2035 年起不再支持使用哺乳動物實驗進行安全性測試的研究[12]。基于相關法律法規的頒布和大家對“3R” 原則（reduction，replacement， refinement） 的關注，建立穩定的體外皮膚模型以減少化妝品行業中傳統的動物實驗十分必要。

體外皮膚模型自20 世紀40 年代起開始大力發展。1948 年，首次出現對體外培養成年哺乳動物皮膚上皮的描述；1975 年，使用成纖維細胞培養的2D 皮膚模型出現；1976 年，第一個體外3D 皮膚模型出現，它更加接近了皮膚的自然結構和功能；隨后出現了更多不同類型的人類皮膚等效物[13–19]。直至今日，已經發展出多種可用于化妝品安全性和功效性評價的功能化皮膚模型，其在化妝品行業中的應用前景十分廣闊。

3.1 皮膚芯片

皮膚芯片（skin-on-a-chip） 是在微流控體系中培養皮膚組織，通過控制大量物理、生物化學參數如培養基流動、機械力、生物化學物質的濃度梯度等模擬真實人體皮膚的三維培養微環境，從而制造具有皮膚層級結構和附屬結構的功能化的三維皮膚組織[20]。微流控設備的主要優點是流體流動和對微環境的精細控制，與靜態培養相比，微流控系統可以精確控制各種參數，如機械力、介質流量和生物化學的梯度，改善細胞分化、形態、功能、細胞- 細胞和細胞- 基質相互作用，在皮膚芯片中集成成熟皮膚層和皮膚附屬器官，且使其具有屏障功能[21–23]。

典型的皮膚芯片包括一個transwell 支架或一層多孔膜，將皮膚模型與底層灌注的培養基分開，允許藥物或細胞因子等大分子擴散到皮膚模型中[24]。皮膚組織通常是由原代來源分離的細胞、干細胞分化的皮膚細胞或從活檢組織中獲得的皮膚所制造的[24]。主要相關細胞有角質形成細胞和成纖維細胞，也包括內皮細胞、黑色素細胞、免疫細胞等其他細胞，以及部分附屬器官，例如血管、毛囊等[25，26]。

皮膚芯片應用于化妝品行業的優勢不僅在于其更加還原人體真實皮膚結構，還能進行形態、活性、生化指標以及屏障功能、滲透性等皮膚特定功能檢測，并支持在芯片上集成多種原位生物傳感器，以提供更豐富的功能，如實時皮膚功能檢測和藥物動力學反應[27]。

3.2 安全性評估

在新的化妝品成分投放市場之前，需要對其安全性進行多方面評估，包括急性毒性、腐蝕和刺激、皮膚致敏等，皮膚芯片在安全性評估中主要用于皮膚致敏和皮膚刺激試驗的毒理學評價。

3.2.1 毒理學評估

Jong Seung Lee 等人[28] 報道了一種能夠對藥物和化妝品化合物進行詳細毒理學評估的混合人體皮膚芯片（ 見圖1a）。該研究構建的皮膚—神經和皮膚—肝臟混合模型可以與代表性的分析方法相結合，如鈣成像檢測神經元活性、GSH/ROS 檢測肝毒性，以進行實時定量皮膚致敏分析和皮膚施用化學物質的潛在肝毒性評估，有助于定量評估皮膚施用化學物質的毒理學效應。

3.2.2 化學刺激評估

Jing Zhang 等人[29] 構建了一種直接在微流控芯片內培養和分化人類角質形成細胞的高仿真表皮芯片（見圖1b）， 主要通過細胞毒性對10 種已知毒素和非毒素的化學品進行體外刺激評價，且對刺激反應進行進一步評估，如炎癥細胞因子釋放等。檢測結果表明，該皮膚芯片是體外皮膚刺激評估的潛在替代方案。同時，該系統還集成了TEER 傳感器，可為后續檢測提供便利。

3.3 功效評價

3.3.1 有效成分篩選

在開發化妝品的過程中，需要花費大量時間用于篩選有效活性成分及其組合。Zhengkun Chen 等人[30] 構建了一個在仿生和動態培養環境中生長大量真皮成纖維細胞球體（dermal fibroblast sphere，DFS）的微流控平臺（見圖2）。該團隊先在芯片上培養形成DFS，再探究不同劑量的維生素C 對DFS 生產I 型膠原蛋白和纖維連接蛋白的影響，實現在3 天內高效篩選維生素C 對蛋白質合成的影響。概念驗證設計中，可以在單個芯片上實現12 種不同的成分或成分組合的高通量篩選，大大提高有效成分篩選的工作效率，縮短化妝品研發周期。

3.3.2 透皮吸收評價

在化妝品開發的過程中，化妝品通過皮膚屏障的滲透能力十分關鍵，需要對化妝品及其活性成分進行透皮吸收進行測試。相比于傳統的Franz 細胞擴散法，使用皮膚芯片檢測不僅能規避倫理問題和物種差異，也能更好地模擬皮膚微循環，得到更有效的數據。

Gopu Sriram 等人[31] 設計了一種用于全層人體皮膚的集成培養和測試的新型微流控裝置（見圖3a）。皮膚模型可以直接在設備中重建，并支持對其進行滲透和毒性研究。通過TEER 評價了皮膚組織的完整性，并通過滲透性實驗比較了化合物咖啡因在皮膚芯片模型和靜態皮膚模型中的穩態轉運。實驗證明，該裝置能顯著提高皮膚模型的質量和功能，并具有在同一平臺上進行皮膚安全和滲透測試等下游檢測的優勢（ 見圖3b）。

Varga-Medveczk 等人[32] 所開發的微流控擴散室（Microfluidic Diffusion Chamber，MDC） 可用于局部化妝品經皮吸收的體外/ 離體監測，并可根據具體實驗需求進行部分改裝。在驗證試驗中，將含咖啡因的乳膏放置在微芯片供體隔室中，并使用外周灌注，將人工皮膚中與人體皮膚中的咖啡因轉運進行比較，結果顯示出相似的轉運動力學和良好的再現性。另外還研究了兩種p 糖蛋白底物紅霉素和奎尼丁在p 糖蛋白抑制劑PSC-833 存在和不存在情況下的透皮滲透曲線。以上實驗表明，MDC 系統可用于研究皮膚芯片微流控系統與透皮成分傳遞和真皮屏障轉運蛋白之間的相互作用，在化妝品透皮吸收評價中很有應用價值。

3.3.3 抗衰評價

體內衰老是由人體的代謝過程所引起的，外表老化與長期暴露于紫外線及其他環境因素有關[33]。人們期望使用化妝品達到預防或逆轉皮膚老化的效果，以保持年輕健康的皮膚外觀。因此有很多關于皮膚老化及抗衰老的研究正在不斷開展[34，35]。

Subin Jeong 等人[36] 基于具有人類成纖維細胞和角質形成細胞的全層三維皮膚的柔性皮膚芯片，使用光交聯劑和反映晝夜節律的機械刺激環境開發老化皮膚模型（見圖4a，b）。在28 天的比較培養中，該模型全層皮膚當量收縮減少，表皮層厚度減少，β- 半乳糖苷酶基因表達增加，記錄并證明了衰老的過程。這種新型芯片皮膚衰老模型的使用有望揭示新的衰老機制，可用于新的抗衰老物質的篩選和功效測試，對抗衰老化妝品的開發具有重要意義。

Gun Yongo Sung[37] 等人利用其所在團隊開發的基于無泵PDMS 芯片系統的全層皮膚芯片（ 見圖4c），檢測姜黃葉提取物（CLLE） 作為一種化妝品原料對皮膚抗衰老的作用，結果顯示50 μg/mL 的CLLE 作用后能顯著增強皮膚模型的屏障功能，并且從基因、蛋白水平均顯示絲聚蛋白、內批蛋白的表達增高。此研究表明，該無泵皮膚芯片模型可以作為動物研究的替代方案用于化妝品行業。

3.3.4 美白測試

黑色素的過度表達可導致黃褐斑等皮膚疾病，色素沉著問題也是醫學領域的研究熱點之一[38]。出于對美容和健康的雙重考慮，人們對美白化妝品的需求逐步增加，檢測化妝品的美白功效也成為產品開發的重要環節之一。

Qiwei Li 等人[39] 設計了一種可進行半固體、固體物質測試的三單元表皮芯片（ 見圖5a）。在芯片中培養正常人角質形成細胞和正常人黑素細胞后，生成的穩定黑色素表皮呈現出多層結構，并具有屏障功能。該團隊使用此表皮芯片測試了一種化妝品的美白效果，通過表征與分析證明了該化妝品在減少黑色素合成方面的功效（ 見圖5b）。同時還使用該表皮芯片測試了四種化學物質的刺激和滲透特性。測試結果表明，該皮膚芯片可以為皮膚刺激或滲透的體外評估以及美容評估提供一種替代方法。

04總結與展望

隨著微流控技術的不斷發展，其在化妝品安全與功效評價中的應用也更加豐富多樣。微流控技術和生物傳感器的結合可以實現對化妝品中的重金屬、微生物、抗生素進行快速檢測，大大提高了檢測特異性、靈敏度，進一步縮短了檢測時間。但目前仍存在傳感器識別精度不夠準確，穩定性差，制備周期長等問題，還有待進一步改進。

此外，生物傳感器不能用于檢測化妝品中的所有物質，如防腐劑等。

皮膚芯片結合了微流控、微傳感、組織工程等多種技術，能對真實人體皮膚進行一定程度上的模仿，有望部分替代傳統動物試驗。雖然目前已經出現多種皮膚芯片，但皮膚芯片真正商業化還面臨著各種難題，如細胞類型的缺失、皮膚附屬物的缺失、微血管的復制、皮膚表面微環境的構建等等，故而還原人體皮膚的程度有限，仍需進一步發展。2022 年12 月，我國第一個器官芯片國家標準《皮膚芯片通用技術要求》通過立項評審，將推進該領域技術發展和行業規范化。總體來說，皮膚芯片作為一項能集成多種原位生物傳感器、聯合多器官芯片的新興技術，在實現多種化妝品評價方面的發展潛力是巨大的。