桃核承氣湯對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

王毅，王海嬌，祁麟，崔玉嬌，陳曉，王巖，何紅美△

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種常見的內分泌及生殖系統疾病，其主要特征有雄激素分泌過多、排卵功能障礙和慢性無排卵，影響全球4%育齡女性的健康［1-2］。PCOS的病因及遺傳背景十分復雜，發病機制尚不清楚，目前的治療僅是對癥治療，缺乏有效的治療藥物［3］。研究發現，磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol 3-kinase/serine/threonine protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）信號通路與卵巢功能調節密切相關，其在PCOS大鼠卵巢中處于顯著抑制狀態，激活該通路能有效促進卵泡發育及改善排卵障礙［4］。源自《傷寒論》的桃核承氣湯由桃仁、大黃、甘草、桂枝及芒硝組成，在臨床中常用于治療盆腔炎、子宮內膜異位癥等婦科疾病［5-6］。但桃核承氣湯是否對PCOS 亦有治療作用鮮見研究報道。本研究嘗試通過分析桃核承氣湯對PCOS 模型大鼠卵巢組織PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響，以期探討其對PCOS的治療作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8 周齡雌性SPF 級SD 大鼠100 只，體質量（230±10）g，購自青島博隆實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（魯）2021-0015，在光照12 h/d 的常規環境中飼養。

1.1.2 主要試劑和儀器 注射用脫氫表雄酮（批號SCBYS9180，南京北魚生物科技有限公司）；二甲雙胍（批號20210912，二甲雙胍用生理鹽水溶成濃度0.01 g/mL 的混懸液，石家莊以嶺藥業股份有限公司）；空腹血糖（FPG）檢測試劑盒、逆轉錄試劑盒、ECL 試劑（批號FS13987、FS14229、FS17124，上海撫生實業有限公司）；空腹胰島素（FINS）檢測試劑盒、熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（批號MK6678B、MK6012，北京寰宇科創生物科技發展有限公司）；卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、睪酮（T）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（批號ZY7070-1、ZY7125-3、ZY7163-5、ZY7255-1、ZY9013-7，上海澤葉生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒、兔抗鼠PI3K、AKT、mTOR、磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化AKT（p-AKT）、GAPDH 抗體、羊抗兔二抗（批號B00101-100、B4292、B9272、B2983、B2118、B4288、B2063、B7074，上海東寰生物科技有限公司）；WM-000 型血糖儀、Chameleon V 型酶標儀、VideometerLab UV 型凝膠成像儀（上海恪敏生物科技有限公司）；DMi8型顯微鏡、Mic-4型qRT-PCR儀（上海之江生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 桃核承氣湯制備 桃仁12 g、大黃12 g、甘草12 g、桂枝6 g，全部浸泡1 h 后，桃仁與甘草大火煎20 min 后加桂枝煎煮10 min，再加入大黃煎10 min后過濾殘渣再煎30 min，合并兩次煎液（第1 次煎煮后過濾殘渣再煎30 min，為第2 次）后加入芒硝6 g，濃縮為含0.189 g/mL、0.378 g/mL、0.756 g/mL生藥的藥液備用。

1.2.2 PCOS模型構建及分組給藥 參照文獻［7］構建PCOS模型：取84只大鼠進行造模，造模大鼠連續20 d于皮下注射脫氫表雄酮（60 mg/kg，脫氫表雄酮溶于0.2 mL 的注射用油劑）。于第21天開始連續4 d（1個動情周期）將生理鹽水潤濕后的棉拭子插入大鼠陰道內，逆時針轉動3次后取出，進行涂片，觀察造模大鼠陰道涂片，若陰道上皮持續角化、失去動情周期則為造模成功。4 只（4.76%）大鼠因仍存在動情周期即造模失敗，80 只（95.24%）大鼠造模成功。另取16 只健康大鼠，連續20 d于皮下注射0.2 mL生理鹽水作為對照組。將成功造模的80只大鼠按照隨機數字表法分為PCOS組，二甲雙胍組，桃核承氣湯低、中、高劑量組，每組16只。二甲雙胍組大鼠給予0.1 g/kg二甲雙胍灌胃［7］；桃核承氣湯低、中、高劑量組大鼠分別給予1.89 g/kg、3.78 g/kg、7.56 g/kg 桃核承氣湯灌胃［8］；對照組和PCOS組大鼠給予生理鹽水灌胃；各組灌胃體積均是10 mL/kg，1次/d，為期28 d。

1.2.3 大鼠血清指標檢測 實驗結束后禁食12 h，于次日早晨尾靜脈取血0.5 mL，通過血糖儀檢測FPG，戊巴比妥鈉麻醉大鼠后取腹主動脈血4 mL，離心（3 000 r/min、15 min）取上清液，使用FSH、LH、E2、T、FINS ELISA 試劑盒檢測各指標水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）=FPG×FINS/22.5。

1.2.4 HE染色 取血完畢后，頸椎脫臼處死8只大鼠，取其左側卵巢組織，浸入4%多聚甲醛，經固定、脫水及石蠟包埋處理后，連續5μm切片，HE著色、封片，光鏡下觀察染色情況。

1.2.5 qRT-PCR 檢測大鼠卵巢組織PI3K、AKT、mTOR mRNA表達情況 取血完畢后，取另8只大鼠頸椎脫臼處死，取其左側卵巢組織，經生理鹽水清洗后保存于-80 ℃冰箱中（一部分用于qRT-PCR 實驗，一部分用于蛋白免疫印跡實驗）。將卵巢組織于研缽中研磨，并使用Trizol 法提取總RNA，檢測其純度及濃度，于冰上反轉錄成cDNA 后，qRTPCR 檢測PI3K、AKT、mTOR mRNA 表達。qRT-PCR 擴增條件：95 ℃5 min，95 ℃15 s、55 ℃15 s 進行40 個循環，72 ℃30 s。反應體系共20μL：2μL cDNA（50 mg/L），10μL SYBR Green Master Mix，PCR上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，補充ddH2O 至20μL。通過2-ΔΔCt法分析各mRNA 表達水平，引物序列見表1，GAPDH為內參。引物由南京北魚生物科技有限公司合成。

Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6 蛋白免疫印跡法檢測大鼠卵巢組織PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達 取1.2.5所得卵巢組織，用組織裂解液裂解后勻漿，離心10 min（15 000 r/min），取上清液，BCA法檢測上清液中蛋白濃度。配制10%分離膠、上樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉至PVDF膜后，使用5%牛血清白蛋白封閉2 h，孵育兔抗鼠PI3K（1∶700）、AKT（1∶750）、mTOR（1∶820）、p-PI3K（1∶700）、p-AKT（1∶750）、GAPDH（1∶900）一抗過夜，次日經TBST 洗滌后孵育羊抗兔二抗（1∶1 900），漂洗后添加ECL 試劑顯影，利用蛋白凝膠成像儀對條帶進行掃描觀察，Image J分析各條帶灰度值，以GAPDH為內參計算目的蛋白表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 桃核承氣湯對PCOS大鼠血清性激素水平的影響 與對照組相比，PCOS組血清FSH、E2水平降低，LH、T 水平升高（P＜0.05）；與PCOS 組相比，二甲雙胍組及桃核承氣湯低、中、高劑量組血清FSH、E2水平升高，LH、T水平降低（P＜0.05）；與二甲雙胍組相比，桃核承氣湯低、中劑量組血清FSH、E2水平降低，LH、T 水平升高（P＜0.05），高劑量組變化差異無統計學意義（P＞0.05）；桃核承氣湯低、中、高劑量組血清FSH、E2水平依次升高，LH、T 水平依次降低（P＜0.05）；見表2。

Tab.2 Changes in serum sex hormone levels in each group of rats表2 各組大鼠血清性激素水平變化（n=16，）

Tab.2 Changes in serum sex hormone levels in each group of rats表2 各組大鼠血清性激素水平變化（n=16，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與PCOS 組比較，c與二甲雙胍組比較，d與低劑量組比較，e與中劑量組比較，P＜0.05；表3—5同。

組別對照組PCOS組二甲雙胍組低劑量組中劑量組高劑量組F FSH（IU/L）3.50±0.68 1.03±0.34a 3.41±0.45b 1.76±0.38bc 2.56±0.40bcd 3.39±0.41bde 80.629＊＊LH（IU/L）11.08±1.14 18.91±1.42a 11.39±1.40b 16.24±1.03bc 14.03±1.26bcd 11.20±1.04bde 111.039＊＊E2（pmol/L）24.14±3.25 6.03±0.98a 22.94±2.36b 10.20±1.35bc 16.03±1.52bcd 21.09±2.06bde 204.619＊＊T（ng/L）17.92±3.38 86.36±6.20a 18.76±5.33b 60.52±5.79bc 41.75±4.20bcd 20.01±4.92bde 488.227＊＊

2.2 桃核承氣湯對PCOS 大鼠胰島素抵抗的影響 與對照組相比，PCOS 組血清FPG、FINS 和HOMA-IR 水平升高（P＜0.05）；與PCOS 組相比，二甲雙胍組及桃核承氣湯低、中、高劑量組血清FPG、FINS 和HOMA-IR 水平降低（P＜0.05）；與二甲雙胍組相比，桃核承氣湯低、中劑量組血清FPG、FINS 和HOMA-IR 水平升高（P＜0.05），高劑量組變化差異無統計學意義（P＞0.05）；桃核承氣湯低、中、高劑量組血清FPG、FINS 和HOMA-IR 水平依次降低（P＜0.05）；見表3。

Tab.3 Changes of insulin resistance in each group of rats表3 各組大鼠胰島素抵抗水平變化（n=16，）

Tab.3 Changes of insulin resistance in each group of rats表3 各組大鼠胰島素抵抗水平變化（n=16，）

組別對照組PCOS組二甲雙胍組低劑量組中劑量組高劑量組F FPG（mmoL/L）5.59±0.38 7.80±0.33a 5.66±0.35b 7.01±0.30bc 6.42±0.41bcd 5.69±0.40bde 97.499＊＊FINS（mIU/L）64.17±5.10 124.23±7.86a 68.30±6.24b 101.25±5.33bc 85.00±6.27bcd 70.02±7.30bde 212.257＊＊HOMA-IR 15.94±2.21 43.07±3.28a 17.18±2.52b 31.55±3.76bc 24.25±2.02bcd 17.71±3.43bde 209.213＊＊

2.3 桃核承氣湯對PCOS大鼠卵巢組織病理學的影響 HE染色結果顯示，對照組大鼠卵巢黃體結構正常，可見不同發育階段的卵泡，未見多囊樣變；PCOS組大鼠卵泡體積增大，含卵泡液，且細胞間隙增大、黃體減少、泡膜細胞層增生；與PCOS組相比，二甲雙胍組及桃核承氣湯低、中、高劑量組大鼠卵泡體積減小、黃體數目增加、泡膜細胞層增生現象減輕；與二甲雙胍組相比，桃核承氣湯高劑量組上述現象無明顯差異；見圖1。

Fig.1 Histopathological observation of ovary in each group of rats(HE staining，×200)圖1 各組大鼠卵巢組織病理學觀察（HE染色，×200）

2.4 桃核承氣湯對PCOS 大鼠卵巢組織中PI3K、AKT、mTOR mRNA 表達的影響 與對照組相比，PCOS 組大鼠卵巢組織中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與PCOS組相比，二甲雙胍組及桃核承氣湯低、中、高劑量組大鼠卵巢組織中PI3K、AKT、mTOR mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與二甲雙胍組相比，桃核承氣湯低、中劑量組大鼠卵巢組織中PI3K、AKT、mTOR mRNA 表達水平降低（P＜0.05），高劑量組變化差異無統計學意義（P＞0.05）；桃核承氣湯低、中、高劑量組大鼠卵巢組織中PI3K、AKT、mTOR mRNA 表達水平依次升高（P＜0.05）；見表4。

Tab.4 Changes of PI3K,AKT and mTOR mRNA expression levels in ovarian tissue of rats in each group表4 各組大鼠卵巢組織中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達水平變化（n=8，）

Tab.4 Changes of PI3K,AKT and mTOR mRNA expression levels in ovarian tissue of rats in each group表4 各組大鼠卵巢組織中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達水平變化（n=8，）

組別對照組PCOS組二甲雙胍組低劑量組中劑量組高劑量組F PI3K mRNA 1.00±0.08 0.32±0.04a 1.01±0.07b 0.51±0.06bc 0.78±0.08bcd 0.98±0.10bde 123.934＊＊AKT mRNA 1.01±0.05 0.28±0.03a 1.00±0.10b 0.47±0.06bc 0.72±0.07bcd 0.97±0.11bde 135.045＊＊mTOR mRNA 0.99±0.09 0.16±0.02a 0.98±0.12b 0.40±0.06bc 0.65±0.08bcd 0.96±0.09bde 143.672＊＊

2.5 桃核承氣湯對PCOS 大鼠卵巢組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達的影響 與對照組相比，PCOS 組大鼠卵巢組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與PCOS組相比，二甲雙胍組及桃核承氣湯低、中、高劑量組大鼠卵巢組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與二甲雙胍組相比，桃核承氣湯低、中劑量組大鼠卵巢組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR 蛋白表達水平降低（P＜0.05），高劑量組變化差異無統計學意義（P＞0.05）；桃核承氣湯低、中、高劑量組大鼠卵巢組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR 蛋白表達水平依次升高（P＜0.05）；見表5、圖2。

Fig.2 Protein expression levels of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in ovarian tissue of rats in each group detected by Westren blot assay圖2 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠卵巢組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白的表達

Tab.5 Comparison of protein expression levels of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in ovarian tissue of rats in each group表5 各組大鼠卵巢組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達水平比較（n=8，）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in ovarian tissue of rats in each group表5 各組大鼠卵巢組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達水平比較（n=8，）

組別對照組PCOS組二甲雙胍組低劑量組中劑量組高劑量組F p-PI3K/PI3K 1.69±0.23 0.56±0.06a 1.61±0.27b 0.90±0.09bc 1.28±0.18bcd 1.58±0.20bde 47.072＊＊p-AKT/AKT 1.51±0.26 0.43±0.07a 1.49±0.27b 0.78±0.07bc 1.12±0.15bcd 1.47±0.21bde 44.354＊＊mTOR/GAPDH 1.39±0.20 0.32±0.04a 1.36±0.19b 0.66±0.06bc 0.98±0.10bcd 1.34±0.19bde 73.491＊＊

3 討論

PCOS的特點是雄激素分泌過多、排卵異常及存在增大或多囊卵巢，是目前女性常見的內分泌疾病，常合并發生高胰島素血癥、血脂異常，亦是糖尿病和心血管疾病發生的危險因素［9-10］。目前PCOS 的病因尚未明確，治療主要基于臨床癥狀和經驗，且不能完全治愈PCOS，口服避孕藥是現今主要的治療方法，但過多服用會增加靜脈血栓栓塞的風險，因此仍需進一步研發其治療藥物［11-12］。

中醫認為PCOS 病因為腎虛為本，病機為痰濕、肝郁、瘀血［13］。桃核承氣湯由桃仁、大黃、甘草、桂枝及芒硝配置而成，大黃逐瘀瀉熱、桃仁活血祛瘀、桂枝通行血脈、芒硝瀉熱、甘草緩和護胃，諸藥合用有活血、化瘀、瀉熱之功效［6］。桃核承氣湯已用于臨床治療慢性盆腔痛［14］、血瘀型子宮內膜異位癥［15］等婦科疾病。有學者認為桃核承氣湯可能具有治療PCOS患者閉經癥狀的功效［16］。PCOS通常與患者胰島素抵抗的發生有關，抑制胰島素分泌可逆轉卵巢功能障礙，并降低雄激素水平［17］。本研究發現，桃核承氣湯能夠以劑量依賴性的方式增加PCOS 大鼠血清FSH、E2水平，降低LH、T、FPG、FINS 及HOMA-IR水平，并改善卵巢病理損傷程度；桃核承氣湯高劑量組上述指標與二甲雙胍組無明顯差異，提示桃核承氣湯能夠有效改善PCOS 大鼠性激素的分泌及胰島素抵抗，其可能成為PCOS的潛在治療藥物。

PI3K屬于生長因子超家族成員之一，可通過激活AKT、mTOR 等通路下游因子發揮作用。有研究發現，PI3K/AKT/mTOR 信號通路參與調節包括代謝、生長和細胞增殖在內的細胞功能，且可控制不同生長因子和激素分泌過程［18-19］。有研究表明，PI3K/AKT/mTOR 信號通路異常會導致卵巢功能損傷，影響卵泡增殖，致使胰島素抵抗的發生［20］。桂枝茯苓丸可通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路來抑制顆粒細胞自噬，促進卵泡發育，從而改善PCOS 胰島素抵抗大鼠排卵障礙［4］。納米姜黃素可通過恢復PCOS大鼠PI3K/AKT/mTOR 通路，減輕胰島素抵抗，促進大鼠性激素恢復正常水平［21］。本研究結果顯示，PCOS 大鼠卵巢組織中PI3K/AKT/mTOR 通路相關分子mRNA 和蛋白表達受到抑制，與以往研究結果一致［4］，而桃核承氣湯以劑量依賴性的方式顯著增加卵巢組織中PI3K/AKT/mTOR 通路相關分子mRNA 和蛋白表達水平，提示桃核承氣湯可促進PCOS 大鼠PI3K/AKT/mTOR 通路的激活，其對PCOS大鼠性激素水平及胰島素抵抗的改善作用可能與激活該通路有關。

綜上所述，桃核承氣湯能夠促進PCOS大鼠性激素正常水平的恢復，抑制胰島素抵抗，這可能與其促進PI3K/AKT/mTOR 信號通路激活有關，但其對PI3K/AKT/mTOR 信號通路的具體作用機制尚待進一步探究。