航天誘變小麥突變體籽粒表型分析和真實性鑒定

張福彥,朱保磊,陳曉杰,王嘉歡,程仲杰,范家霖,張建偉

(1.河南省科學院 同位素研究所有限責任公司,河南省核農學重點實驗室,河南 鄭州 450015;2.信陽市農業(yè)科學院,河南 信陽 464000)

小麥是我國最主要的口糧作物,在國家糧食安全戰(zhàn)略中具有極其重要的地位。從近年來國家冬小麥區(qū)域試驗品系的遺傳多樣性和產量結果看,當前我國小麥育種面臨資源狹窄、模式單一等問題,嚴重制約著小麥產量的提高[1-2]。從糧食生產的發(fā)展進程來看,糧食產量的每次重大突破都與一些關鍵優(yōu)異種質資源的利用密切相關,其已成為制約我國糧食增產潛力的關鍵因素[3]。航天誘變是利用特殊空間環(huán)境,使植物性狀發(fā)生改變,之后經過地面人工選育出新品種、新材料以及特色基因資源的育種技術,為解決目前生產上小麥新品種同質化嚴重、親本資源遺傳基礎狹窄等問題提供了有效途徑[4-5]。

1987年,我國首次利用返回式衛(wèi)星將第1批農作物種子帶到太空,開始進行航天誘變育種研究,經過幾十年的發(fā)展,我國航天育種技術研究和應用得到迅速發(fā)展,已取得了大量突破性的成果[6-7]。目前,航天誘變研究已逐步深入到突變體基因變異、表達以及轉錄組、蛋白質組變異特征等基因組學和分子生物學領域[8-9],但受天然異交混雜或人為混雜等因素影響,在一定程度上存在假突變體的可能性,而利用表型分析通常難以鑒定誘變后代突變體的真實性,這嚴重影響了突變體中功能基因的遺傳研究。隨著分子生物學技術不斷發(fā)展,利用分子標記技術可以有效鑒定誘變后代中優(yōu)異突變體的真實性[10]。

郭奕生等[11]篩選出4對簡單重復序列標記(Simple sequence repeats,SSR)核心引物用于不同水稻品種的真實性鑒定,從而為加強水稻品種權的保護及種子質量監(jiān)測工作提供重要理論依據。張維宏等[12]以甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate,EMS)誘變處理小麥抗葉銹病近等基因系TcLr19的種子,共鑒定出146個M3感病突變體。為保證結果的可靠性,同時利用Lr19的分子標記對突變體進行分子篩選,鑒定出M36-2、M333-8、M333-9、M333-11、M344-4和M396-8等6個遺傳穩(wěn)定率達70%以上的M3感病突變材料,可用于抗病基因功能和機制研究。馬超等[13]以EMS誘變小麥-西爾斯山羊草Pm57易位系為材料,利用Pm57基因特異分子標記和小麥全國區(qū)試品系進行特異性、一致性和穩(wěn)定性(Distinctness,uniformity and stability,DUS)測試所用的42對SSR核心引物,鑒定篩選出70個Pm57基因白粉病抗性喪失的真實突變體。王春語等[14]利用擴增目標條帶較單一、多態(tài)性豐富的30個SSR標記對高粱EMS誘變突變體的真?zhèn)芜M行鑒定,發(fā)現(xiàn)篩選的≥3 bp重復的30個SSR分子標記完全可以用于鑒定EMS誘變高粱突變體的真?zhèn)巍Ｒ陨险f明,采用SSR標記技術對水稻、小麥、高粱等誘變突變體真實性鑒定是完全可行的。但SSR標記受位點數(shù)量和方法的限制,無法從全基因組水平上對突變體進行高通量真實性鑒定。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是普遍存在于生物基因組中的一種新型分子標記,是在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,具有在基因組中分布密度高、代表性強、遺傳穩(wěn)定性高、易實現(xiàn)高通量自動化檢測和分析等優(yōu)點[15-16]。耿皆飛等[17]利用90K SNP芯片對小麥品系H261及其EMS突變體進行檢測,發(fā)現(xiàn)突變體與其親本的相同SNP位點的一致性高達99.2%以上,且二者之間沒有發(fā)現(xiàn)純合差異SNP,認為突變體與親本H261的遺傳背景高度一致,是經過EMS誘變的后代,可以進行后續(xù)的功能基因遺傳研究。楊麗娟等[18]采用15K SNP芯片數(shù)據分析了15份黑、紫色小麥種質資源的遺傳差異,共獲得7 116個有效SNP位點,SNP多態(tài)性比率為77.12%,每條染色體上有128～682個SNP位點,且在A、B、D染色體組中不均勻分布,SNP標記的數(shù)量表現(xiàn)為B組>A組>D組,15份小麥種質資源之間的遺傳相似度為44.58%～99.94%,可見SNP芯片技術可以準確鑒定出不同小麥材料的遺傳相似度。

小麥籽粒發(fā)育狀況決定著小麥的產量和品質,因此,籽粒遺傳發(fā)育機制一直是小麥研究的熱點之一。優(yōu)異籽粒突變體是小麥高產育種的重要親本資源,也是研究小麥籽粒發(fā)育機制和相關基因克隆的重要材料。小麥產量性狀突變體的鑒定對于解析小麥籽粒發(fā)育和產量形成均具有重要意義。Wu等[19]利用誘變技術獲得產量性狀相關突變體Meh0239,與野生型相比,該突變體從苗期開始表現(xiàn)出明顯的表型差異,包括株高降低,葉片變寬變短,穗、小穗和籽粒縮短以及小穗分布更加緊密等,進一步研究發(fā)現(xiàn),由于小麥7DS染色體上的一個隱性突變(Yt1)致使小麥植株體內脫落酸、吲哚-3-乙酸等內源性激素水平的改變,從而導致該突變體產量相關性狀表現(xiàn)明顯差異。Zhang等[20]從利用EMS誘變小麥品種煙農15產生的突變體庫中獲得大粒突變體M8008,構建其F2及其衍生的F2:3群體,并對控制籽粒大小相關基因進行精細定位、克隆以及功能分析等,發(fā)現(xiàn)大粒親本M8008在2D染色體上控制粒寬和千粒質量的QTL(QGw和QTgw)具有減少粒寬和降低千粒質量的作用。截至目前,國內外研究人員基于各種需求已構建多個小麥突變群體或突變體庫,并對單個突變性狀進行評估,但同時利用SSR標記和SNP芯片對航天誘變小麥突變體進行真實性鑒定的研究尚無報道。本研究以河南省科學院同位素研究所前期利用實踐十號衛(wèi)星搭載創(chuàng)制周麥18 SP5籽粒突變群體為材料,對其籽粒表型進行分析,同時利用SSR標記和55K SNP基因芯片技術對籽粒表型差異較為顯著突變體材料的真實性進行鑒定,旨在為進一步利用籽粒突變體進行小麥遺傳改良、功能基因克隆、轉錄組測序等后續(xù)研究提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

138份周麥18 SP5籽粒突變群體是前期利用實踐十號衛(wèi)星搭載周麥18(ZM18)干種子而誘變創(chuàng)制的,且經過連續(xù)多代自交后,各性狀已基本能夠穩(wěn)定遺傳。所有材料于2020年10月種植于河南省科學院新鄭試驗基地,每個SP5突變體材料種植2行,且每隔20行種植2行野生型對照(CK),行長2.5 m,行距0.25 m,每行播50粒種子,待出苗后每行定苗至30株左右,每個突變體株行按田間試驗序號如ZM18-01、ZM18-02、ZM18-03等依次編號。田間管理同大田生產,正常成熟后人工收獲,及時晾曬,儲藏備用。

1.2 表型測定

粒長和粒寬測定:每個SP5突變體材料和野生型對照材料中均隨機取出20粒,重復3次,利用20 cm得力塑料直尺測量粒長和粒寬。

千粒質量測定:采用Contador型全自動數(shù)粒儀(德國福弗公司)進行種子計數(shù),每個突變體材料和野生型對照材料均取1 000粒,重復3次;并采用LT1002E型電子天平(常熟市天量儀器公司)進行稱質量。

1.3 SSR標記檢測

從籽粒表型差異較為顯著的突變體材料和野生型對照中各隨機選取5粒種子,混合粉碎后分別放入3個2 mL離心管中,采用SLS(十二酰肌氨酸鈉)法快速提取小麥籽粒DNA,具體操作根據Chen等[21]提取DNA的方法而改進。

利用小麥染色體上分布均勻、多態(tài)性信息指數(shù)高、特異性和穩(wěn)定性較好的42對SSR引物[22]對部分SP5突變體及其親本進行檢測。PCR反應體系為20 μL,主要包括10×Buffer 2.0 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4 μL,dNTP(200 μmol/L)1.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,模板DNA 2.0 μL,ddH2O 13.6 μL。在Tprofessional standard型PCR儀(Biometra)中進行擴增,PCR反應程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,55～65 ℃(依據不同引物的退火溫度改變)退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應程序結束后,取5 μL PCR擴增產物用6.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,按照郭培國等[23]銀染方法進行操作,用Fire Reader凝膠成像系統(tǒng)拍照,并保存至計算機以備統(tǒng)計分析。

1.4 SNP芯片分析

委托北京博奧晶典生物技術有限公司利用美國昂飛公司(Affymetrix,Inc.)研發(fā)的Axiom Wheat 55K 384S384 Layout芯片檢測SP5中籽粒表型差異較為顯著的突變體及其野生型對照材料的全基因組SNP,檢測方法編號AG-XN-WL01-01-2012,SNP芯片的多態(tài)性分析采用GeneChip?Operating Software(GCOS)Version 1.2軟件。

1.5 統(tǒng)計與分析

利用Excel 2013軟件進行所有試驗數(shù)據的統(tǒng)計,并對138份周麥18 SP5籽粒突變體材料及其野生型對照的粒長、粒寬和千粒質量等籽粒表型進行差異顯著性分析。同時對籽粒表型差異較為顯著的4個突變體進行SSR標記檢測和SNP芯片分析。

2 結果與分析

2.1 籽粒表型分析

野生型對照周麥18的粒長、粒寬和千粒質量分別為13.40 cm、7.00 cm和48.16 g,同等條件下,對138份周麥18 SP5突變體籽粒表型分析發(fā)現(xiàn),突變群體的平均粒長、粒寬和千粒質量均顯著高于其野生型。突變群體中以千粒質量的變異最為豐富,變異系數(shù)較高,為8.30%;其次是粒長;而粒寬變化范圍最小,變異系數(shù)最低,僅為3.61%(表1)。

表1 周麥18 SP5籽粒突變體籽粒表型分析Tab.1 Analysis of grain phenotype of Zhoumai 18 SP5 grain mutants

進一步分析發(fā)現(xiàn)存在多個籽粒表型差異較為顯著的突變體材料,從中選取4份千粒質量差異較大的突變體ZM18-7、ZM18-26、ZM18-105和ZM18-112進行表型分析和真實性鑒定。從圖1可知,周麥18突變型籽粒與其野生型的籽粒表型存在顯著差異(P<0.05)。大粒突變體ZM18-26和ZM18-112的千粒質量、粒長與野生型相比存在顯著性差異,小粒突變體ZM18-7和ZM18-105的千粒質量、粒長與野生型相比也均存在顯著性差異,但其粒寬與野生型相比差異不顯著。

不同小寫字母表示同一性狀變異存在顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).

2.2 突變體SSR標記檢測

SSR標記分子檢測結果表明,突變體ZM18-112與其野生型的差異標記為18個,多態(tài)性比例高達42.85%,而突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與其野生型的差異標記分別為1,0,2個,多態(tài)性比例分別為2.38%,0,4.76%(表2、圖2)。根據王立新等[24]提出的雜株判定標準,在待測小麥品種的種子之間,比對核心SSR分子標記位點的帶型,當差異標記≥3個位點的帶型不同時,表示差異個體與親本之間的遺傳相似性低,存在異花授粉或機械混雜的可能性,即可判定為雜株。突變體ZM18-112與其野生型周麥18的差異標記位點為18個,故可以判定航天誘變突變體ZM18-112是由異花授粉或機械混雜產生的假突變體,而突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與其野生型周麥18的差異標記位點均≤3個,說明突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與野生型周麥18的遺傳背景基本一致,是經過航天誘變而產生的真實突變體。

A.Barc80; B.Cfd72; C.Gwm285; D.Cfd29; E.Cfd76; F.Wmc522; G.Barc164;H.Gwm495; I.Barc345; J.Gwm44.1.ZM18-CK; 2.ZM18-112; 3.ZM18-105; 4.ZM18-26; 5.ZM18-7。

表2 周麥18 SP5突變體與野生型之間的42個SSR標記多態(tài)性檢測Tab.2 Polymorphism of 42 SSR markers between SP5 mutants and wild type of Zhoumai 18

2.3 突變體SNP芯片分析

為進一步鑒定突變體的真實性,同時分析航天誘變突變體的遺傳背景與其野生型之間的關系,利用Axiom Wheat 55K 384S384 Layout芯片的53 063個SNP標記對周麥18及其SP5中籽粒表型差異較為顯著的突變體進行多態(tài)性分析。結果發(fā)現(xiàn)(表3),突變體ZM18-112與野生型的差異SNP位點高達7 058個,占SNP總數(shù)的13.301 2%,其中純合SNP位點多態(tài)性數(shù)量為2 609個,占總數(shù)的4.9168%,進一步分析發(fā)現(xiàn),這些差異SNP位點隨機分布在除1A和1D以外的染色體上;而突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與野生型的差異SNP位點分別為386,315,408個,分別占總數(shù)的0.7274%,0.5936%,0.7689%,其中純合SNP位點多態(tài)性數(shù)量分別為110,63,166個,分別占總數(shù)的0.2073%,0.1187%,0.3128%,進一步分析發(fā)現(xiàn),這些差異SNP位點主要分布在2B和3D染色體上。上述SNP芯片分析結果從基因組水平上進一步證實了ZM18-112與其野生型的遺傳背景差異較大,是假突變體,而ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7則為周麥18經過航天誘變而產生的真實突變體,可進行功能基因克隆、轉錄組測序等后續(xù)研究。

表3 周麥18 SP5突變體與野生型之間的SNP標記多態(tài)性檢測Tab.3 Polymorphism of SNP marker between SP5 mutants and wild type of Zhoumai 18

3 結論與討論

航天誘變對小麥的株高、穗長、產量以及品質等性狀均有重要影響,航天誘變的性狀遺傳穩(wěn)定快,有益性狀的變異頻率高。王美芳等[25]研究發(fā)現(xiàn),小麥種子經航天誘變后能引起后代表現(xiàn)型的廣泛變異,但不同品種和不同性狀對空間環(huán)境的敏感性、誘變效果不同,SP3株高、穗長、產量性狀、品質性狀的變異尤為突出。本研究僅對航天誘變突變體的籽粒表型進行分析,結果表明,周麥18 SP5突變群體中的籽粒表型變異尤為豐富,以千粒質量的變異系數(shù)最大,粒寬變異系數(shù)最小,且該突變群體的粒長、粒寬和千粒質量均值均顯著高于野生型。然而,對上述航天誘變獲得籽粒表型差異較為顯著的突變體進行誘導突變分子機制研究時,必須借助于分子標記鑒定技術區(qū)分真實突變體和假突變體。

呂興娜等[26]采用21對核心SSR引物對航天誘變衍生系與親本進行分子檢測,并對其遺傳相似性進行評估,發(fā)現(xiàn)蘭天15的航天誘變衍生系與親本間差異標記數(shù)量在4～12個,且部分性狀發(fā)生嚴重分離,推測可能是由于異花授粉產生的假突變體,而鄭麥9023的航天誘變衍生系與親本間差異標記數(shù)量少于3個,僅有成株期抗性等少數(shù)性狀發(fā)生分離,推測其可能是航天誘變產生的真實突變體。耿皆飛等[17]采用相同的21對核心SSR引物對小麥品系H261及其EMS突變體進行分子檢測,結果發(fā)現(xiàn),H261與突變體LF2010和LF2099的差異SSR標記數(shù)量為0個,但與突變體LF2100的差異SSR標記數(shù)量為10個,多態(tài)性比例為47.62%,進而認為LF2010和LF2099是H261經過EMS誘變產生的真實突變體,而LF2100則是由于天然異交或機械混雜產生的假突變體。本研究利用42對SSR引物(21對核心引物和在小麥染色體上分布均勻、多態(tài)性信息指數(shù)高、特異性和穩(wěn)定性較好的21對擴展引物)對4份千粒質量差異較大的航天誘變突變體ZM18-7、ZM18-26、ZM18-105和ZM18-112進行真實性鑒定,結果表明,航天誘變突變體ZM18-112與其野生型的差異標記為18個,多態(tài)性比例高達42.85%,且多數(shù)性狀發(fā)生嚴重分離,認為ZM18-112是由于異花授粉或機械混雜產生的假突變體,而突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與其野生型的差異標記均不超過3個,且僅有千粒質量等少數(shù)性狀發(fā)生分離,認為突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與野生型的遺傳背景基本一致,是經過航天誘變而產生的真實突變體。

由于SSR與相關序列擴增多態(tài)性(Sequence related amplified polymorphism,SRAP)等標記受位點數(shù)量和方法的限制,即使突變位點發(fā)生在SSR、SRAP等引物結合位點,該突變位點也不一定能被標記檢測出來,故無法從全基因組水平上對突變體進行高通量真實性鑒定。隨著新一代測序技術的快速發(fā)展,高通量測序和SNP芯片技術在水稻、煙草、小麥等作物基因研究上廣泛應用。Cheng等[27]利用γ射線誘變水稻9311得到優(yōu)異突變體Red-1,并對其進行全基因組重測序,結果發(fā)現(xiàn),Red-1的14 493個基因中存在381 403個SNP、50 116個小片段插入/缺失(Insertions/deletions,Indels)、1 279個拷貝數(shù)變異(Copy number variations,CNVs)和10 026個存在/缺失變異(Presence/absence variations,PAVs),改變序列占整個基因組序列的9.19%,而點突變是Red-1基因組的主要變異類型。周世奇等[28]為研究煙草航天誘變機理,對航天誘變突變體進行全基因組重測序,結果表明,突變體NC89-M和其野生型重測序后對比得到271 655個SNP,分布在8 378個基因上,23 450個Indels造成2 156個基因突變,進一步分析發(fā)現(xiàn)航天誘變引起的煙草基因組變異以單堿基突變?yōu)橹鳌９⒔燥w等[17]對小麥品系H261經EMS誘變得到的LF2099、LF2010和LF2100突變體進行高通量SNP芯片檢測和分析,結果發(fā)現(xiàn),在檢測的81 597個SNP中,LF2099和LF2010突變體與野生型之間的差異SNP數(shù)量分別為12,66個,僅占0.0147%,0.0809%,且純合的差異SNP位點均為0個,進一步證實了LF2099和LF2010突變體是EMS誘變產生的真實突變體。Daba等[29]通過全基因組關聯(lián)研究小麥株高,利用測序基因分型產生的38 693個SNP標記,進一步結合表型分析檢測到3個與性狀關聯(lián)緊密的標記(Marker-trait associations,MTAs),即QPLH-2D、QPLH-4B.2和QPLH-4D,能單獨解釋10%～16%的表型變異。本研究利用小麥55K基因芯片的53 063個SNP標記對周麥18及其SP5中籽粒表型差異較為顯著的突變體進行多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)突變體ZM18-112與野生型的差異SNP位點所占比例高達13.301 2%,二者遺傳背景差異較大,是假突變體,而另外3個突變體與野生型的差異SNP位點所占比例不超過0.768 9%,說明它們之間的遺傳差異較小,是航天誘變的真實突變體。以上研究說明,利用高通量測序和SNP芯片技術可以從全基因組水平上對突變體進行高通量真實性鑒定。

綜上,對航天誘變獲得的138份周麥18 SP5突變體籽粒表型進行分析,結果發(fā)現(xiàn),突變群體的千粒質量、粒長差異顯著,其中千粒質量的變異最為豐富,粒寬變異不顯著,且突變群體的粒長、粒寬和千粒質量均值均顯著高于其野生型,說明航天誘變的有益突變頻率較高。同時利用SSR分子標記和55K SNP基因芯片對籽粒表型差異較為顯著的突變體進行真實性鑒定,結果表明,上述2種方法均能夠很好地鑒別出純合基因型與雜合基因型,可以有效鑒定航天誘變突變體的真實性。此外,SNP基因芯片鑒定方法可以在全基因組水平上對突變體進行高通量分析,提供的遺傳信息也更為完整,為進一步利用優(yōu)良突變體進行遺傳改良、功能基因克隆、轉錄組測序等后續(xù)研究提供更為可靠的理論依據。