槲皮素通過調控miR-431-5p/鼠雙微基因4信號通路抑制類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞侵襲和促進凋亡

梁 舒, 左淑飛, 崔玉榮, 秦藝璐, 高 曉, 韓 琛, 范文強

(河南省新鄉市中心醫院/新鄉醫學院第四臨床學院, 1. 風濕免疫科, 2. 婦科婦瘤二科, 河南 新鄉, 453000)

類風濕關節炎(RA)主要損壞關節,女性發生率高于男性[1-3]。RA病理表現通常為免疫細胞浸潤、關節軟骨和骨破壞,研究[4]表明,基因和環境因素影響RA發生。若治療不及時, RA患者通常會出現晨僵、關節強直、關節破壞、畸形甚至殘疾[5-6]。近些年,藥學方面取得的顯著進展為治療RA提供了新方案[7]。槲皮素是一種類黃酮,具有廣泛的有益作用和生物活性,研究[8]指出其具有抗高血壓、抗炎、抗血管生成、抗衰老和神經保護的潛力。滑膜炎癥受槲皮素的調控,其能抑制炎癥細胞因子產生和成纖維樣滑膜細胞(FLSs)增殖和運動,還能通過減少基質金屬蛋白酶的產生來減弱骨損傷,提示槲皮素具有治療RA的潛力[9]。但目前槲皮素調控RA疾病的機制還不明確,研究[10]指出槲皮素可通過介導微小RNAs(miRNAs)表達來調控RA進程。miRNAs 是一類非編碼RNAs,能調控先天免疫及獲得性免疫,一些miRNAs在RA患者關節腔室亞細胞群中表達異常,且能通過調控炎性細胞因子產生和滑膜細胞增殖介導RA發展[11-13]。研究[14-15]表明, miR-431-5p具有抑制RA進程的潛力,但未有明確證據表明槲皮素對RA的調控機制涉及miR-431-5p。因此,本研究圍繞miR-431-5p是否參與槲皮素對RA的調控展開探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RNA抽提試劑盒、無RNA酶水、miR-431-5p抑制劑(anti-miR-431-5p)、抑制劑對照(anti-miR-NC)、miR-431-5p模擬物(miR-431-5p)、模擬物對照(miR-NC)、mRNA熒光定量PCR試劑盒、miRNA熒光定量PCR試劑盒、鼠雙微基因4(MDM4)過表達載體、pcDNA 3.1(+)載體和反轉錄試劑盒購自上海吉瑪制藥技術有限公司; TGem Pro分光光度計、蛋白定量試劑盒、定點突變試劑盒、DAB底物顯色試劑盒和組織研磨低溫均質儀購自天根生化科技(北京)有限公司; 熒光素酶活性檢測試劑盒、基底膜基質、細胞凋亡檢測試劑、蛋白提取試劑盒、CCK-8試劑盒、MDM4和GAPDH一抗抗體、甲醛和結晶紫購自北京索萊寶科技有限公司; 酶標儀、顯微鏡、羊抗兔二抗抗體購自美國Thermo Fisher公司; 槲皮素(貨號#Q4951)購自德國Merck公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RA滑膜組織收集: 該研究得到本院倫理委員會同意。收集不同年齡階段在本院接受膝關節鏡手術的RA患者(27例,平均46歲)和接受骨折手術的非RA患者(25例,平均45歲)的滑膜組織。所有患者均簽署知情同意書,收集的組織及時儲存在-80 ℃環境中。

1.2.2 類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞(RA-FLSs)分離及培養: 在無菌條件下,將收集的RA滑膜組織和正常滑膜組織用剪刀剪成體積約為1 m3的組織塊,放于添加有Ⅰ型膠原蛋白的細胞培養基(DMEM)中,在培養箱中消化2 h。隨后將消化的滑膜組織用細胞過濾網過濾去除多余雜質。將過濾的細胞通過離心收集,收集后的細胞移至含有完全培養基的培養皿中,并放置于5%二氧化碳培養箱中培養,每3 d傳代1次,2～5代的FLSs用于本實驗研究。

1.2.3 RA-FLSs處理與分組: RA-FLSs匯合度在90%～100%時,傳代培養于12孔板,細胞鋪板密度依據后期處理細胞時間而定,待細胞匯合度達75%左右時,將濃度為10、20、30 μmoL的槲皮素分別加入不同培養孔中,對照孔添加二甲基亞砜,以此分為0 μmoL槲皮素處理、10 μmoL槲皮素處理、20 μmoL槲皮素處理以及30 μmoL槲皮素處理細胞,培養2 h后,收集細胞用于RNA表達分析。RA-FLSs匯合度達75%左右時,轉染anti-miR-431-5p、anti-miR-NC、miR-431-5p、miR-NC、MDM4過表達載體和pcDNA(3.1+)載體,轉染后48 h,在每孔中添加20 μmoL的槲皮素或者二甲基亞砜(對照),繼續培養2 h, 以此分為對照組、槲皮素組、槲皮素+anti-miR-NC組、槲皮素+anti-miR-431-5p組、miR-NC組、miR-431-5p組、miR-431-5p+pcDNA組以及miR-431-5p+MDM4組,收集細胞用于后續實驗。

1.2.4 基因表達分析: 利用組織研磨低溫均質儀研磨組織樣品。采用RNA抽提試劑盒提取研磨后的組織和細胞樣品RNA。采用TGem Pro分光光度計定量RNA濃度后,使用mRNA熒光定量PCR試劑盒和miRNA熒光定量PCR試劑盒定量基因表達,利用2-△△Ct法分析定量數據。定量引物序列見表1。

表1 定量引物序列

1.2.5 細胞活力: 將接受轉染和槲皮素處理的RA-FLSs接種到96孔板,按照說明書要求將CCK-8試劑加入相應的培養孔中,細胞孵育4 h后,運用酶標儀分析樣品。

1.2.6 流式細胞儀實驗: 將接受轉染和槲皮素處理的RA-FLSs用結合緩沖液重懸,懸浮的細胞樣品根據操作手冊分別和Annexin V-FITC以及碘化丙啶避光孵育10 min。用流式細胞儀分析細胞樣品,以確定細胞凋亡率。

1.2.7 Transwell實驗: 將經過轉染和槲皮素處理的RA-FLSs接種到提前孵育有基質的培養板上室,該Transwell小室加有不含胎牛血清的培養基,含有15%胎牛血清的培養基加入到相應的Transwell小室下室作為化學引誘物。細胞培養24 h后,將細胞和甲醛以及結晶紫共孵育,最后用顯微鏡觀察下室細胞數量。

1.2.8 熒光素酶活性分析: 為了分析miR-431-5p和MDM4的關系,本研究首先利用Starbase在線數據庫預測miR-431-5p是否含有MDM4 3′UTR結合位點。根據預測的結合位點在生物公司構建了 MDM4熒光素酶實驗所用的載體(WT-MDM4 3′UTR以及MUT-MDM4 3′UTR)。 其中MUT-MDM4 3′UTR的構建需參照點直接突變試劑盒的說明。將WT-MDM4 3′UTR以及MUT-MDM4 3′UTR和miR-431-5p或miR-NC轉染到RA-FLSs中, 48 h后用商業試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.9 MDM4蛋白表達: 用蛋白提取試劑盒提取收集樣品蛋白,提取的蛋白用蛋白定量試劑盒分析,根據測定的蛋白濃度,將相應體積的蛋白樣品進行二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將帶有蛋白條帶的聚偏氟乙烯膜和MDM4、GAPDH一抗過夜孵育,最終用DAB底物顯色試劑盒分析聚偏氟乙烯膜。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 miR-431-5p在滑膜組織、FLSs以及槲皮素誘導RA-FLSs中的表達

miR-431-5p在RA患者滑膜組織和RA-FLSs中的表達低于正常對照組織和對照細胞,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖1A、1B。miR-431-5p在不同濃度槲皮素處理的RA-FLSs中,其表達呈劑量依賴性增高,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖1C。

A: miR-431-5p在RA患者滑膜組織和正常滑膜組織中的表達分析,與對照比較, ***P<0.001;B: miR-431-5p在FLSs中的表達分析,與對照比較, **P<0.01; C: miR-431-5p在不同濃度槲皮素處理的

2.2 miR-431-5p和槲皮素對RA-FLSs凋亡、侵襲的影響

轉染anti-miR-431-5p后,槲皮素處理對miR-431-5p表達的促進作用得到緩解,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖2A。與對照組比較,槲皮素組RA-FLSs活力降低,細胞凋亡率增加,侵襲細胞數減少,差異有統計學意義(P<0.05); 與槲皮素+anti-miR-NC組相比,槲皮素+anti-miR-431-5p組的RA-FLSs細胞活力增加,細胞凋亡率降低,侵襲細胞數增加,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖2B、2C、2D。

A: miR-431-5p表達分析; B: RA-FLSs活力分析; C: RA-FLS凋亡分析; D: 侵襲能力分析(放大倍數為100倍)。

2.3 miR-431-5p在RA-FLSs中結合MDM4

miR-431-5p包含MDM4的結合位點,見圖3A。miR-431-5p和WT-MDM4 3′UTR共轉染導致了RA-FLSs中熒光素酶活性降低,差異有統計學意義(P<0.05), 但miR-431-5p和MUT-MDM4 3′UTR共轉染對RA-FLSs中熒光素酶活性無影響,差異無統計學意義(P>0.05), 見圖3B。MDM4在RA滑膜組織中的表達高于對照滑膜組織,差異有統計學意義(P<0.05); 且RA滑膜組織中MDM4的表達與miR-431-5p呈負相關,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖3C、3D。MDM4在RA-FLSs中的蛋白表達高于正常滑膜組織來源FLSs中的表達,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖3E。

圖3 miR-431-5p在RA-FLSs中結合MDM4

2.4 miR-431-5p通過MDM4調控RA-FLSs的凋亡和侵襲

miR-431-5p組的MDM4蛋白表達低于miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05); miR-431-5p+MDM4組的MDM4蛋白表達高于miR-431-5p+pcDNA組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖4A。與miR-NC組比較, miR-431-5p組中RA-FLSs細胞活力降低,細胞凋亡率增加,侵襲細胞數減少,差異有統計學意義(P<0.05); 與miR-431-5p+pcDNA組比較, miR-431-5p+MDM4組中RA-FLSs細胞活力增加,細胞凋亡率降低,侵襲細胞數增加,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖4B、4C、4D。

A: miR-431-5p和MDM4結合位點; B: miR-431-5p和MDM4結合關系鑒定; C:MDM4mRNA表達分析;

D: miR-431-5p和MDM4表達相關性分析; E: MDM4蛋白表達檢測。

與miR-NC比較, ****P<0.000 1; 與對照比較, ***P<0.001, ****P<0.000 1。

2.5 槲皮素和MDM4對RA-FLSs凋亡和侵襲的影響

槲皮素組的MDM4蛋白表達低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05); 槲皮素+MDM4組的MDM4蛋白表達高于槲皮素+pcDNA組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖5A。與對照組比較,槲皮素轉染組的RA-FLSs活力降低,細胞凋亡率增加,侵襲細胞數減少,差異有統計學意義(P<0.05); 與槲皮素+pcDNA組比較,槲皮素+MDM4組的RA-FLSs細胞活力增加,細胞凋亡率降低,侵襲細胞數增加,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖5B、5C、5D。

A: MDM4蛋白表達分析; B: RA-FLSs細胞活力檢測; C: RA-FLSs凋亡率檢測; D: RA-FLSs侵襲數檢測(放大倍數為100倍)。

3 討 論

槲皮素在蔬菜和水果中廣泛表達,對關節和關節外表現均有影響,能夠抑制氧化應激、促進RA-FLSs凋亡、降低自身抗體水平以及減弱腸神經系統的神經退行性過程[9]。在機制研究方面,相關學者[10, 16-19]已指出,槲皮素能通過抑制中性粒細胞炎癥活動、減少腺甙脫氨酶產生來調控miR-26b、miR-20a、miR-146a和miR-485的表達,限制RA進程。槲皮素通過介導miR-431-5p表達來調控RA中FLSs表型變化。本研究結果表明,在槲皮素處理的RA-FLSs中miR-431-5p表達上調,但miR-431-5p在RA滑膜組織和RA-FLSs中表達下調,這些結果和WANG Y J等[14]的研究一致。此外,本研究發現,在anti-miR-431-5p轉染后,槲皮素處理導致的RA-FLSs凋亡促進和侵襲抑制得到緩解,說明槲皮素能通過上調miR-431-5p表達來調控RA-FLSs凋亡和侵襲。

研究[20]指出, p53在類風濕關節炎滑膜成纖維細胞中低表達,且能調控此類細胞侵襲進程。內源性抑制劑能誘導p53的磷酸化, MDMx蛋白家族成員是一種p53調控蛋白,其中成員MDM4是p53的磷酸化內源性抑制劑之一。研究[21]指出,該蛋白通過結合p53反式激活區域來影響其轉錄功能。研究[22]表明,芍藥苷抑制RA-FLSs增殖、運動和炎癥, MDM4過表達能夠減弱芍藥苷對RA-FLSs的影響。miR-34a-3p表達上調抑制FLSs增殖,其可通過結合MDM4 3′非編碼區的547～554位點來調控細胞增殖。本研究證實,MDM4是miR-431-5p的一個靶基因,MDM4在RA患者滑膜組織和RA-FLSs中表達顯著上調,且與miR-431-5p表達呈負相關。此外, MDM4過表達減弱了槲皮素或miR-431-5p對RA-FLSs侵襲和凋亡的調控作用[23]。

綜上所述,槲皮素可通過調控miR-431-5p/MDM4通路來抑制RA-FLSs侵襲和促進細胞凋亡。槲皮素可能是治療RA的替代藥物,開發miR-431-5p藥物制劑可能對限制RA發展具有幫助。但本研究僅收集了27例RA患者滑膜組織和25例對照滑膜組織,樣品量較少,后期研究應擴大樣品量; 此外,還需采用鼠模型實驗,以鑒定槲皮素是否通過調控miR-431-5p/MDM4通路抑制RA進展。