微小RNA-6779-5p對白細胞介素-1β誘導軟骨細胞損傷的影響及機制研究

左淑飛, 梁 舒, 秦藝璐, 吳 潔, 張 超, 郭占非, 邊彩月, 范文強

(新鄉市中心醫院/新鄉醫學院第四臨床學院 風濕免疫科, 河南 新鄉, 453000)

骨關節炎是一種關節疾病,患者常伴有慢性疼痛、關節僵硬以及身體殘疾等特征,發病率和年齡有關[1-2]。骨關節炎的治療方法有手術治療、非藥物治療(例如運動、減肥和物理治療)和藥物治療,而在藥物治療相關方案中,中西醫結合治療具有絕對優勢[3-5]。微小RNA(miRNAs)是一類單鏈的RNAs, 包含18～25個核酸,不具有編碼蛋白的能力,能夠通過結合基因非編碼區調控基因表達[6-7]。既往研究[8]主要關注miRNAs對腫瘤發展的影響,但炎性相關疾病的發病機制也涉及miRNAs。研究[9]顯示, miRNAs通過介導腸道屏障穩態、炎癥反應和細胞自噬進程參與炎癥性腸病。miRNAs能通過調節宿主防御功能、炎性因子以及抑炎因子的表達來介導包括細菌性肺炎和病毒性肺炎在內的呼吸系統炎癥性疾病發展[10]。研究表明一些miRNAs如miR-29b-5p[11]、miR-1271[12]以及miR-146a[13]可能參與調控骨關節炎的發病進程。miR-6779-5p屬于miRNA家族成員,但尚無相關研究闡明骨關節炎發展是否涉及miR-6779-5p。

研究[14-16]揭示白細胞介素-1β(IL-1β)能通過核因子κB(NF-κB)信號軸調控軟骨損傷。ZHANG J M等[17]采用IL-1β誘導的骨關節炎細胞模型證明中度機械應激能夠通過調控線粒體功能和活性氧清除參與軟骨細胞凋亡。GUO X等[18]采用IL-1β誘導的骨關節炎細胞模型證明了毛蕊異黃酮參與骨關節炎的發生發展。本研究通過瞬時轉染的方法將商業合成的miR-6779-5p模擬物轉染到IL-1β誘導軟骨細胞,通過細胞計數試劑盒8(CCK-8)法、5-乙基-2′-脫氧尿苷(EdU)實驗、流式細胞儀以及熒光素酶報告實驗分析miR-6779-5p對骨關節炎發展的影響及機制,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

采用體外細胞分子生物學實驗。實驗在新鄉市中心醫院風濕免疫科實驗室進行,于2023年2月28日完成。主要試劑有: IL-1β(廣州賽業科技); RNA提取試劑盒(北京天根生化科技); 白細胞介素1受體相關激酶3(IRAK3)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗抗體以及二抗抗體(武漢華美生物); CCK-8試劑盒、BCA定量試劑盒、胎牛血清、蛋白分子量標準、蛋白酶抑制劑、瓊脂糖和NP-40(上海碧云天技術); MiRcute miRNA isolation kit、TGrinder H24R組織研磨低溫均質儀、細胞增殖試劑盒和miR-6779-5p模擬物(廣州銳博科技); Lipofectamine 2000轉染試劑、Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)、聚偏氟乙烯膜、pcDNA3.1載體、磷酸緩沖液、減血清培養基(美國Thermo Fisher公司); IRAK3過表達載體(南京金斯瑞生物); 點直接突變試劑盒和凋亡檢測試劑盒(上海翊圣生物); 本實驗中所用的其他一抗抗體(美國CST公司)。主要儀器有: 蛋白電泳儀和轉模儀(美國Invitrogen公司); 蛋白成像系統(美國UVP公司); 流式細胞儀(美國Thermo Fisher公司); TGrade Lite金屬浴和TGyrate mini渦旋混勻儀(北京天根生化科技)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人體軟骨組織: 人體軟骨標本的收集得到了新鄉市中心醫院倫理委員會的同意,所有參與者均提供了知情同意書。23例骨關節炎軟骨組織是從骨關節炎患者中收集而來, 19例正常軟骨組織由創傷性截肢者提供,這些組織在收集后儲存在-80 ℃冰箱。

1.2.2 細胞培養: 人軟骨細胞(CHON-001, 上海酶研生物)培養在添加有10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養基中,并于37 ℃的培養箱中培養。

1.2.3 誘導實驗: 根據所需培養孔數量準備細胞, CHON-001細胞匯合度達到90%左右時用胰酶進行消化,消化時間依據顯微鏡下細胞狀態而定。將細胞接種到12孔板中,待細胞密度達到50%～70%時,將IL-1β(0、5、10、15 ng/mL)加到所需孔中,并放置到培養箱中維持24 h[19]。將添加0 ng/mL IL-1β(即添加同體積的磷酸緩沖液)的培養孔標記為0 ng/mL組,將添加5、10和15 ng/mL IL-1β的培養孔分別標記為5 ng/mL組、10 ng/mL組和15 ng/mL組。

在細胞轉染的前1 d, 按照實施轉染實驗的時間,調整CHON-001細胞密度并接種到12孔板中,培養過夜,將Lipofectamine 2000轉染試劑和miR-6779-5p或miR-NC在旋渦震蕩儀上混勻,參照說明書的要求靜置15 min, 隨后依次將混合液加到培養孔中,將培養皿在操作工作臺上輕輕搖晃后放置在培養箱中孵育48 h, 隨后與10 ng/mL IL-1β或者同體積的磷酸緩沖液孵育24 h,并標記為control組、IL-1β組、IL-1β+miR-NC組以及IL-1β+miR-6779-5p組。以同樣方法標記IL-1β+miR-6779-5p+pcDNA組和IL-1β+miR-6779-5p+IRAK3組。

1.2.4 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)分析RNA表達: 利用NanoDrop-1000設備檢測提取的RNA濃度。樣品濃度提前稀釋到規定的濃度范圍,根據商業化的反轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA。將cDNA稀釋5倍,參照以下標準設置20 μL定量體系定量RNA表達: 2 μL cDNA模板、上游引物和下游引物各0.5 μL、10 μL SuperReal PreMix Color和7 μL雙蒸水。將cDNA稀釋5倍,參照以下標準設置20 μL定量體系定量miRNA表達: 2 μL cDNA模板、miRNA特異引物和mRQ 3′引物各0.5 μL、10 μL TB Green Advantage Premix和7 μL雙蒸水。基因的定量是在IQ5熱循環儀上進行的。以2-△△Ct法分析基因表達,引物序列見表1。

表1 定量分析引物序列

1.2.5 細胞活力分析: 將CHON-001細胞在96孔板上培養并接受細胞轉染以及IL-1β處理操作,隨后根據CCK-8試劑盒的說明將CCK-8試劑加入培養孔中, 4 h后檢測樣品光密度值。

1.2.6 細胞增殖實驗: 將經過細胞轉染和IL-1β處理的軟骨細胞培養在96孔板上2 h(實驗前已加入標準濃度50 μmol/L EdU), 隨后根據說明書的要求將多聚甲醛加入培養孔中。在軟骨細胞和4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液孵育后,利用熒光顯微鏡分析EdU陽性的細胞。

1.2.7 細胞凋亡分析: 采用結合緩沖液將細胞重懸,隨后將細胞和膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)以及碘化丙啶避光孵育10 min。采用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗: 采用PCR技術將包含預測miR-6779-5p結合位點的IRAK3 3′非編碼區(3′UTR)擴增并插入到pmirGLO載體,命名WT-IRAK3 3′UTR。采用點直接突變試劑盒將IRAK3 3′UTR中的5′-CCTCCCAG-3′突變成5′-GGAGGGTC-3′, 以相同方式構建MUT-IRAK3 3′UTR。將報告質粒和miR-6779-5p或miR-NC轉染到軟骨細胞中,48 h后采用雙熒光素酶報告實驗試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.9 蛋白表達分析: 采用NP-40裂解液裂解樣品以提取樣品蛋白,蛋白濃度分析利用BCA試劑盒完成。根據測定的蛋白濃度,計算20 μg蛋白所需體積,將相應體積的蛋白樣品采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)處理。將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在脫色搖床中和稀釋過的IRAK3、GAPDH、p-P65、P65、IκBα和p-IκBα一抗抗體在4 ℃環境下孵育12 h。PVDF膜在脫色搖床經過洗滌后與二抗孵育2 h。最后利用圖像分析系統分析PVDF膜。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 miR-6779-5p在骨關節炎患者軟骨組織和IL-1β刺激的CHON-001細胞中低表達

本研究首先利用GEO數據庫(GEO數據登錄號: GSE175961)篩選了骨關節炎患者中表達異常的miRNAs, 并羅列了表達較低的前7位miRNAs(圖1A); 隨后又鑒定了前2位miRNAs的表達量(miR-1285-5p和miR-6779-5p), 與miR-1285-5p相比, miR-6779-5p在骨關節炎患者中表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)(圖1B); miR-6779-5p在骨關節炎患者軟骨組織中的表達較正常對照組降低,差異有統計學意義(P<0.05)(圖1C), 且IL-1β處理能夠在CHON-001細胞中呈濃度依賴性地減少miR-6779-5p的表達,差異有統計學意義(P<0.05)(圖1D)。

A: GEO數據庫分析骨關節炎患者中表達較低的前7位miRNAs; B、C: miR-1285-5p以及miR-6779-5p表達分析,與正常對照組比較, *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.000 1; D: 不同濃度IL-1β處理對CHON-001細胞miR-6779-5p的表達影響,與0 ng/mL比較, *P<0.05, ***P<0.001。

2.2 miR-6779-5p模擬物減弱了IL-1β誘導的軟骨細胞損傷

與control組相比, IL-1β組中miR-6779-5p的表達降低,差異有統計學意義(P<0.05); 與IL-1β+miR-NC組比較, IL-1β+miR-6779-5p組中miR-6779-5p的表達升高,差異有統計學意義(P<0.05)(圖2A)。與control組相比, IL-1β組中軟骨細胞活力和EdU陽性率降低,細胞凋亡率增加,差異有統計學意義(P<0.05); 與IL-1β+miR-NC組比較, IL-1β+miR-6779-5p組中軟骨細胞活力和EdU陽性率升高,細胞凋亡率降低,差異有統計學意義(P<0.05)(圖2B、2C、2D)。

A: miR-6779-5p和IL-1β處理對miR-6779-5p表達的影響; B、C、D: miR-6779-5p和IL-1β處理對細胞活力、增殖和凋亡的影響(放大400倍)。與IL-1β比較, ***P<0.001, ****P<0.000 1; 與IL-1β+miR-NC比較, **P<0.01, ***P<0.001。

2.3 miR-6779-5p和IRAK3的關系鑒定

IRAK3和miR-6779-5p結合位點見圖3A。本研究發現,相對熒光素酶活性在WT-IRAK3 3′UTR和miR-6779-5p共轉染后降低,差異有統計學意義(P<0.05), 但在MUT-IRAK3 3′UTR和miR-6779-5p共轉染后相對熒光素酶活性變化差異無統計學意義(P>0.05)(圖3B)。IRAK3在骨關節炎患者軟骨組織中的表達較正常對照組更高,差異有統計學意義(P<0.05)(圖3C), 且在骨關節炎患者軟骨組織中的表達與miR-6779-5p表達呈負相關(P<0.05)(圖3D)。IL-1β處理能夠在CHON-001細胞中呈濃度依賴性地增加IRAK3的表達,差異有統計學意義(P<0.05)(圖3E)。

2.4 miR-6779-5p通過結合IRAK3減弱IL-1β誘導的軟骨細胞損傷

與control組相比, IL-1β組中IRAK3的表達升高,差異有統計學意義(P<0.05); 與IL-1β+miR-NC組比較, IL-1β+miR-6779-5p組中IRAK3的表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)(圖4A)。與control組相比, IL-1β組中軟骨細胞活力和EdU陽性率降低,細胞凋亡率增加,差異有統計學意義(P<0.05); 與IL-1β+miR-NC組比較, IL-1β+miR-6779-5p組中軟骨細胞活力和EdU陽性率升高,細胞凋亡率降低,差異有統計學意義(P<0.05)(圖4B、4C、4D)。然而, IRAK3過表達后減弱了miR-6779-5p對IRAK3表達、細胞活力、細胞增殖以及細胞凋亡的影響,差異有統計學意義(P<0.05)(圖4A、4B、4C、4D)。

A: IRAK3表達分析; B、C: miR-6779-5p和IRAK3對細胞增殖的影響(放大400倍); D: miR-6779-5p和IRAK3過表達在IL-1β處理的軟骨細胞中對細胞凋亡的影響。與control組比較, ****P<0.000 1; 與IL-1β+miR-NC比較, **P<0.01, ***P<0.001;與IL-1β+miR-6779-5p+IRAK3比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.5 miR-6779-5p在IL-1β處理的軟骨細胞中通過介導IRAK3調控NF-κB通路

miR-6779-5p模擬物在IL-1β誘導的軟骨細胞中減少p-P65和P65比值以及p-IκBα和IκBα的比值,差異有統計學意義(P<0.05), 但是這些影響在IRAK3過表達后緩解,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

與control組比較, ****P<0.000 1; 與IL-1β+miR-NC比較, ****P<0.000 1;與IL-1β+miR-6779-5p+pcDNA比較, ***P<0.001, ****P<0.000 1。

3 討 論

miRNAs的特殊基因沉默特性使得這類非編碼RNAs參與不同疾病的發展過程[6, 20-21]。骨關節炎發病機制涉及miRNAs, miRNAs的低表達會造成骨骼生長缺陷[22]。這些小RNAs介導軟骨細胞凋亡和增殖[23-24]。最近的研究數據[25-26]指出miR-6779-5p與腫瘤惡性有關,但尚無數據報道其是否參與骨關節炎的發生發展。本研究運用GEO數據庫篩選發現miR-6779-5p表達在骨關節炎患者中顯著降低,并且qRT-PCR分析證實了此結果; 本研究結果還表明miR-6779-5p在IL-1β誘導的軟骨細胞中表達下調,且呈劑量依賴性。此外, miR-6779-5p逆轉了IL-1β對軟骨細胞增殖的抑制作用和對凋亡的促進作用。

miRNAs在轉錄后水平通過和靶基因結合來介導基因表達,進而調控細胞分化、致癌性轉化以及細胞增殖等生物學進程[27]。本研究分析發現miR-6779-5p靶標IRAK3。IRAK3屬于IRAK家族成員,該家族蛋白是一類胞漿蛋白,在先天性免疫中具有重要作用[28]。此外,體外的骨關節炎模型[29]揭示IRAK3下調有助于關節軟骨損傷的恢復,相關機制涉及miR-33b-3p對IRAK3的靶向調控作用。研究[19]指出IRAK3參與骨關節炎發展,本研究數據表明IRAK3高表達促進骨關節炎軟骨細胞損傷,說明IRAK3在骨關節炎關節軟骨中表達增加以及IRAK3有助于骨關節炎發展。不同的是,本研究指出IRAK3結合miR-6779-5p調節軟骨細胞損傷。研究[28, 30]顯示IRAK3過表達減弱了miR-6779-5p對細胞增殖和凋亡的影響。鑒于IRAK3能夠通過激活NF-κB通路參與炎癥反應,本研究又分析了miR-6779-5p在IL-1β處理的軟骨細胞中是否通過介導IRAK3調控NF-κB通路,結果顯示miR-6779-5p減少p-P65和P65比值以及p-IκBα和IκBα的比值,但是這些影響在IRAK3過表達后得到緩解,說明了骨關節炎的發病進程可能涉及miR-6779-5p/IRAK3/NF-κB通路調控。

綜上所述, miR-6779-5p通過抑制IRAK3/NF-κB通路的激活來挽救IL-1β誘導的軟骨細胞損傷,表明miR-6779-5p可能是治療骨關節炎的潛在靶點。但本研究只利用骨關節炎的細胞模型鑒定miR-6779-5p/IRAK3/NF-κB通路在骨關節炎發展中的作用,后期還應開展相應的動物模型實驗來驗證此通路在骨關節炎發展中的作用。