食品中豬源性成分定性檢測能力驗證結(jié)果與分析

程瀟　徐晨　賈貞　劉娟娟　安虹

摘要 本文根據(jù)中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心提供的能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書以及SN/T 2051—2008、GB/T 38164—2019、SN/T 3730.8—2013 3種方法對2個肉糜樣品進行豬源性成分檢測，通過參加中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心食品中豬源性成分鑒定能力驗證，驗證實驗室動物源性成分檢測的能力，擴大實驗室的影響力。結(jié)果表明，3種方法均可在樣品22-W514中檢出豬源性成分，在樣品22-K216中未檢出豬源性成分，本次能力驗證獲得滿意結(jié)果。

關(guān)鍵詞 豬源性成分；檢測能力驗證；食品

中圖分類號 TS251.7? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）08-0162-03

食品安全關(guān)乎生命與健康，隨著人類經(jīng)濟社會的持續(xù)發(fā)展和生活水平的不斷提高，人們對食品安全問題提出了越來越高的要求。近些年，隨著我國食品市場物品種類的豐富，加工領(lǐng)域的不斷創(chuàng)新，食品添加劑的廣泛使用，食品真實性、品質(zhì)鑒定和質(zhì)量安全等相關(guān)問題也逐漸凸現(xiàn)[1]。如何快速鑒別食品的真、偽、優(yōu)、劣成為食品市場管理的重點和難點。

國內(nèi)市場上的肉和肉制品的生產(chǎn)與銷售中，有些不法商販會利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者，其中以低價的肉冒充高價的肉最為常見，如用雞肉冒充豬肉，用豬肉、鴨肉冒充牛、羊肉等[2]。因此，對肉類制品及其加工品進行摻假、摻雜檢驗十分必要，其重點就是快速、準確地鑒定肉制品品種[3-4]。目前，最常見的動物源性成分檢測方法是基于分子生物學(xué)檢測技術(shù)的熒光定量PCR法[5]，本實驗室采用3種熒光定量PCR方法，分別對2個樣品進行豬源性成分的檢測。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

樣品由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心提供。樣品編號分別為22-W514、22-K216，采用真空密封鋁箔袋包裝。

1.2 試驗試劑

本次能力驗證使用GB/T 38164—2019及SN/T 3730.8—2013方法進行豬源性成分檢測的引物、探針依據(jù)標準中公布的序列進行合成（大連寶生物），使用SN/T 2051—2008方法進行豬源性成分檢測，試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。本次試驗采用的Premix Ex Taq? （Probe qPCR）、RNase Free水均購自寶生物工程（大連）有限公司，基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 試驗設(shè)備

7500實時熒光PCR儀（美國ABI公司）；高速冷凍離心機（賽默飛世爾）；電子天平（梅特勒-托利多）；振蕩恒溫金屬浴（賽默飛世爾）；Thermo NanoDrop 2000核酸分析儀（賽默飛世爾）。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品DNA的提取。根據(jù)作業(yè)指導(dǎo)書的要求，分別取50 mg處理好的樣品放置于2 mL離心管中，每個樣品做2個平行試驗。按照基因組提取試劑盒說明書要求提取DNA，提取完成后使用Thermo NanoDrop 2000分別對DNA進行測定。

1.4.2 熒光PCR擴增。熒光PCR檢測循環(huán)條件按照相對應(yīng)的標準要求進行設(shè)置，其中陽性對照用含有豬源性成分的肉制品為模板，陰性對照使用未含有豬源性的肉制品為模板，空白對照用ddH2O代替模板，反應(yīng)體系均為25 μL。其中GB/T 38164—2019熒光PCR檢測循環(huán)條件為95 ℃ 10 min；40個循環(huán)為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。SN/T 3730.8—2013熒光PCR檢測循環(huán)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；45個循環(huán)為95 ℃ 15 s，58 ℃ 1 min。SN/T 2051—2008熒光PCR檢測循環(huán)條件為95 ℃ 10 s；40個循環(huán)為95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s。檢測結(jié)束后，分別根據(jù)擴增曲線和Ct值綜合對結(jié)果進行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 GB/T 38164—2019體系豬源性成分檢測結(jié)果

圖1顯示試驗空白對照無FAM熒光信號檢出，未出現(xiàn)典型的擴增曲線；陰性對照無FAM熒光信號檢出，未出現(xiàn)典型的擴增曲線；陽性對照有FAM熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值小于35.0，本次試驗有效。樣品22-W514，有FAM熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值小于35.0；樣品22-K216，無FAM熒光信號檢出，Ct值大于40.0。依據(jù)GB/T 38164—2019判定要求，判定22-W514為陽性樣品，22-K216為陰性樣品。

2.2 SN/T 3730.8—2013體系豬源性成分檢測結(jié)果

圖2顯示實驗空白對照無FAM熒光信號檢出，無熒光對數(shù)增長，Ct值大于40.0；陰性對照無FAM熒光信號檢出，無熒光對數(shù)增長，Ct值大于40.0；陽性對照有FAM熒光信號檢出，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值小于30.0，本次試驗有效。樣品22-W514，有FAM熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值小于35.0；樣品22-K216，無FAM熒光信號檢出，Ct值大于40.0。依據(jù)SN/T3730.8—2013判定要求，判定22-W514為陽性樣品，22-K216為陰性樣品。

2.3 SN/T 2051—2008體系豬源性成分檢測結(jié)果

圖3顯示試驗空白對照及陰性對照均無FAM熒光信號檢出，有VIC熒光信號檢出，且Ct值均小于28.0；陽性對照有FAM和VIC熒光信號檢出，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值均小于28.0，本次試驗有效。樣品22-W514，有FAM和VIC熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值小于35.0；樣品22-K216，無FAM熒光信號檢出，Ct值大于40.0，有VIC熒光信號檢出，Ct值小于35.0。依據(jù)SN/T 2051—2008判定要求，判定22-W514為陽性樣品，22-K216為陰性樣品。

3種不同方法試驗結(jié)果一致，均判定樣品22-W514檢出豬源性成分，樣品22-K216未檢出豬源性成分。

3 討論

目前，在生物學(xué)領(lǐng)域動物源性成分的鑒定方法以核酸分析為主，以核酸為基礎(chǔ)的方法包括普通PCR、熒光PCR、聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性等。其中熒光PCR技術(shù)具有快速、簡便、靈敏、高特異性等優(yōu)點，擴增反應(yīng)可在線實時監(jiān)控，尤其是在PCR擴增完成后不需要開蓋對擴增產(chǎn)物進行后續(xù)處理，極大地降低了交叉污染的可能，從而避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。由于該方法具有檢測時間短、靈敏性高、特異性好等特點，目前已成為肉制品品種鑒別最常用的方法。

分子試驗不僅僅會因為實驗室氣溶膠污染導(dǎo)致最終結(jié)果錯誤，DNA提取過程、體系配制、甚至操作失誤等多方面原因也有可能導(dǎo)致試驗失敗。因此在熒光PCR擴增檢測時，不僅僅需要在每一種參數(shù)檢測過程中設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照，還需要在DNA提取過程中設(shè)置試劑提取空白對照，這樣就可以避免由于提取試劑盒本身的污染導(dǎo)致后續(xù)試驗失敗。此外，在對動物源性成分鑒定結(jié)果進行判定時，不能僅僅根據(jù)熒光PCR儀直接給出的Ct值進行判斷，還需要結(jié)合是否出現(xiàn)擴增曲線以及閾值是否滿足要求進行綜合判定，以保證最終結(jié)果的準確性。目前大多數(shù)動物源性成分檢測標準還都是基于定性的方法，定量檢測的方法研究主要基于高通量的檢測方法以及數(shù)字PCR，但是這些方法存在著工作量大、操作繁瑣、對檢驗者及設(shè)備要求高等缺點，目前還尚未廣泛運用在動物源性成分的定量檢測中，這就要求對現(xiàn)有設(shè)備和技術(shù)進行不斷升級優(yōu)化，制定出易于推廣的動物源性成分定量檢測方法。

本次試驗結(jié)果表明，選用3種方法均可以對豬源性成分進行正確判定。需要指出的是，3種方法中SN/T 3730.8—2013僅可以對豬源性成分進行鑒定；SN/T 2051—2008可以對豬、牛、羊3種動物源性成分進行鑒定，但是檢測過程可以控制在1 h以內(nèi)；GB/T 38164—2019可以對包括豬、牛、羊在內(nèi)的20余種動物進行源性成分鑒定，所以在平時的工作中，各實驗室可以根據(jù)自身的要求選擇合適的檢測方法。

能力驗證是檢驗實驗室水平的重要手段之一[6-7]，根據(jù)中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心公布的此次能力驗證的結(jié)果，樣品22-W514和22-K216均獲得“滿意”結(jié)果，證明本實驗室具有對食品中豬源性成分進行有效鑒定的能力。

4 參考文獻

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[2] 蕭揚，潘良文. DNA檢測技術(shù)讓摻假肉制品無所遁形[J]. 食品與生活，2014（3）：24.

[3] 黃惠敏，張東升，李岳樺. PCR技術(shù)在牛羊肉制品成分鑒定及摻假鑒別中的應(yīng)用[J]. 食品安全導(dǎo)刊，2016，135（12）：22-23.

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[6] 陳雨欣，朱榮，石建華. 牛肉粉末中豬源性成分定性檢測FAPAS能力驗證結(jié)果與分析[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，9（20）：5324-5327.

[7] 李俊霞，朱虹霖，周浩，等. 食品中馬源性成分定性檢測能力驗證結(jié)果與分析[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2020，11（22）：8491-8495.

（責(zé)編：王 菁）

作者簡介 程瀟（1982—），男，安徽六安人，高級工程師。研究方向：食品檢驗。

收稿日期 2023-02-06