肉鵝制品中松香酸和脫氫松香酸殘留的高效液相色譜檢測方法

李金玲　白昊鑫　馬晶晶　劉?！」⒅久鳌±罱鹌健⊥醯罓I　徐為民

摘要：松香甘油酯是我國推薦使用的畜禽脫毛劑，研究表明，松香甘油酯在合成和使用過程中均能檢出游離松香，這些殘留的松香在脫毛過程中可能殘留于畜禽胴體，而肉鵝制品中松香殘留情況尚缺乏研究。在前期松香殘留分析工作的基礎上，以松香酸（AA）和脫氫松香酸（DHAA）作為松香的標志物，采用固相萃取對樣品進行除雜和富集，高效液相二極管陣列檢測器串聯熒光檢測器同時分析市場流通領域中肉鵝制品中2種目標化合物的含量。該方法具有重復性好、靈敏度高的特點，松香酸和脫氫松香酸的檢出限分別為0.015 μg/g和0.003 μg/g。市場上流通的生、熟肉鵝制品中AA的陽性檢出率均高達80%，AA含量分別在2.82～14.52 μg/g和0.64～9.6 μg/g范圍，而生、熟肉鵝制品DHAA的陽性檢出率分別為80%和60%，DHAA含量分別在1.62～10.06 μg/g和0.06～2.62 μg/g范圍。研究結果表明，市場上流通領域的肉鵝制品中普遍檢出松香殘留，這些殘留的松香進入消費者餐桌，存在食品安全隱患。

關鍵詞：肉鵝制品；松香酸；脫氫樅酸；固相萃??；高效液相色譜法

中圖分類號：TS207文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0174-05

我國是世界肉鵝生產和消費大國，相比其他家禽，肉鵝羽毛具有分布更密集、毛層厚實、絨多且細長等特點［1］，這些因素導致肉鵝宰后脫毛難度更大。脫毛是肉鵝屠宰加工過程中的重要環節，脫毛干凈與否是制約肉鵝制品生產和銷售的瓶頸問題之一［2］。傳統的脫毛方法主要包括熱燙、機械打毛、二次脫毛等步驟，熱燙和機械脫毛可以去除大部分羽毛，二次脫毛主要采用黏附性較好的脫毛劑去除殘留在頭、頸、翅、臀等部位的細小微絨毛。

松香和松香甘油酯是2種常用的畜禽脫毛劑，二者在適當加熱條件下可由固態轉化成液態，此時較好的黏附性能，可以附著在畜禽胴體表面，遇冷凝固成膜，撕去膜的同時可達到除殘毛的效果［3］。松香是一種天然的樹脂固體晶體，具有來源廣、價格低等優點，曾長期用于鴨、鵝、豬蹄、豬耳等的二次脫毛加工［4-5］。松香酸（Abietic acid，AA）和脫氫松香酸（Dehydroabietic acid，DHAA）是松香的標志性成分［6-11］，研究表明，AA和DHAA均有一定的毒理學性質［12-14］，在光、熱、氧和金屬離子等因素的誘導下，易發生氧化反應，生成的產物具有致敏性［15-16］。采用松香脫毛，易導致AA和DHAA殘留在胴體表皮組織中，引發食品安全問題，因此，我國已禁止松香用于屠宰加工脫毛，推薦松香甘油酯作為替代產品［17］。松香甘油酯是松香的改性產物，松香中的羧酸類化合物和甘油在催化劑作用下發生酯化，生成一甘酯、二甘酯和三甘酯等產物（圖1），相比松香，松香甘油酯具有穩定性好、酸值低等優點。但松香甘油酯作為脫毛劑，使用過程也存在一些問題：一是相比松香，松香甘油酯成分更加復雜，工業化生產偏重酸價和色度等指標來判斷產物等級，而忽視了松香的真實酯化程度，此外，松香甘油酯的酯化程度、成分分析、含量分析等方面尚缺乏必要的研究，市場上流通的松香甘油酯品質難以鑒別和監控［18-19］；二是松香甘油酯的工業合成存在酯化不完全現象，導致游離松香殘留，采用松香甘油酯用于畜禽脫毛仍可導致松香殘留的情況發生［20］，這些殘留的松香進入消費者的餐桌，同樣會引發食品安全問題；三是松香甘油酯價格比松香高，實際生產過程中使用量大，無疑會增加企業的成本，在脫毛效果和利益的雙重脅迫下，部分企業仍違規使用松香進行屠宰加工脫毛。筆者所在課題組前期研究表明，市場上流通領域的白條鴨胴體松香殘留情況較普遍［21-23］，殘留的松香經水洗、烹飪加工不能完全消除，肉鴨熟制品仍有游離松香殘留［6］。上述原因造成了市場上“松香產品”屢禁不止現象，這些殘留的松香尚不能有效區分來源，而現階段市場上流通的肉鵝制品中松香殘留情況尚缺乏研究，因此，對市場上的肉鵝制品進行松香殘留分析顯得尤為必要。

筆者所在課題組前期建立了同時檢測肉鴨制品中AA和DHAA方法，采用固相萃取凈化、高效液相分析方法［22］。肉鵝表皮組織富含油脂、蛋白等成分，會干擾AA和DHAA的分析檢測，本研究采用固相萃取對肉鵝表皮組織進行除雜和富集AA和DHAA。AA和DHAA這2種化合物的同時檢測采用高效液相二極管陣列檢測器（PDA）串聯熒光檢測器（FLR）來實現。由圖2可見，AA和DHAA是一類三環二萜類的樹脂酸，AA因結構中存在共軛的不飽和碳碳雙鍵，在紫外區域有良好的吸收特性，可采用紫外或二極管陣列檢測器對AA進行含量分析，而DHAA分子結構中含有苯環，兼具紫外和熒光特性，且在熒光檢測器下表現出更高的靈敏度，能滿足更低含量的檢測要求，可采用熒光檢測器對DHAA進行含量分析。因此，本研究采用固相萃取對采集的肉鵝制品進行凈化和松香富集，二極管陣列串聯熒光檢測器的高效液相分析同時檢測樣品中AA和DHAA含量。該方法具有靈敏度高、操作便捷等優點。本研究以AA和DHAA為松香殘留標志物，采用高效液相法分析生、熟肉鵝胴體中松香殘留情況，為現階段市場流通領域中的肉鵝制品中松香情況提供數據和分析方法，對于國家質量監管、保護消費者食品安全具有重要意義。

1材料與方法

1.1原料與試劑

肉鵝制品均購自南京孝陵衛農貿市場及附近蘇果超市、北京華聯超市，所有樣品采樣后，取不同部位的表皮、肌肉（胸肉和腿肉，去除筋膜），攪碎，混勻，置于密封袋中-20 ℃避光保存。

AA（標準試劑，HPLC純度≥90%）和DHAA（標準試劑，HPLC純度≥98%）上海源葉試劑有限公司；色譜純乙腈，上海泰坦科技股份有限公司；色譜純甲酸，上海麥克林生化科技股份有限公司；水由Millipore純水儀制備；其他試劑均為分析純；C18固相萃取（solid phase extraction，SPE，3 mL）小柱，美國Supelco公司。

1.2儀器與設備

高效液相色譜儀Waters e2695（配有PDA和FLR），美國Waters公司；固相萃取儀，美國Alltech科技有限公司；氮氣濃縮儀N-Evap 112，美國 Organomation公司；Direct-Q3uv超純水機，美國Millipore；電子分析天平PTX-FA210S，福州華志科學儀器；臺式冷凍離心機Unicen MR，德國 Hero lab公司；HS2060A超聲波振蕩器，常州國華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1標準溶液的配制分別稱取適量AA和DHAA，用乙腈溶解，分別配制成1 mg/mL和 0.1 mg/mL 的儲備液。取適量等體積上述儲備液混勻，用乙腈梯度稀釋，分別配制成AA系列濃度為0.1～20 μg/mL，DHAA系列濃度為0.01～2.00 μg/mL 的混合標準溶液。

1.3.2樣品處理參照文獻［14］的方法并略有改動：稱取1 g（精確至0.001 g）混合均勻的樣品置于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈，充分混勻后超聲水浴振蕩10 min，室溫離心（10 000 r/min，10 min）。另取潔凈10 mL離心管，吸取4 mL上清液，加入等體積的去離子水混勻后作為固相萃取上樣液，固相萃取小柱上樣前依次用乙腈和去離子水各3 mL活化，上樣后，用3 mL 40%乙腈溶液淋洗，最后用 2 mL 甲醇洗脫收集，收集液經氮氣吹掃儀濃縮干燥后，用適量乙腈復溶，經0.22 μm有機濾膜過濾，置于-20 ℃保存，待HPLC分析。每個樣品取3個平行，測試結果以平均值±標準差表示。

1.3.3色譜條件色譜柱：XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（體積比84 ∶16）；流速：1 mL/min；PDA檢測波長：240 nm，FLR 激發和發射波長分別為 225 nm 和287 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.4數據及圖像分析

試驗數據采用Excel 2016軟件進行處理，數據結果以平均值±標準差表示；圖像采用Chemdraw 16.0及Powerpoint 2016繪制。

2結果與分析

2.1色譜條件的優化

在筆者所在課題組前期研究［6］的基礎上，對高效液相檢測的色譜條件進行優化，主要對流動相試劑種類、流動相比例進行優化，固定0.1%甲酸水溶液作為水相，以乙腈代替甲醇作為有機流動相時，在不影響分離度的情況下，可以明顯縮短AA和DHAA的保留時間，與此同時，DHAA的熒光吸收響應值要比甲醇作為流動相時高，可以滿足更低濃度的檢測。通過流動相比例優化，可以得出，隨著水相比例的提高，可以延長AA和DHAA的出峰時間，當乙腈和水相體積比調為84 ∶16時，可使目標物和雜質分離開來，又能滿足檢測保留時間的需求。綜合2種標志物分離度、峰形、保留性、響應值等方面的綜合考慮，最終采用的流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（體積比84 ∶16），流速為1 mL/min，AA和DHAA的保留時間分別為13.4 min和9.0 min（圖3）。

2.2方法的線性范圍、檢測限和定量限

本試驗采用外標法定量肉鵝制品中的AA和DHAA，以標準系列濃度作為橫坐標x，相應的峰面積為縱坐標y，分別繪制AA和DHAA標準曲線，AA和DHAA的回歸方程分別為y=11 596x-159.1和y=2 200 587.2x-6 715.3，線性相關系數均高于0.999，表明在選擇的濃度范圍內，2種化合物的濃度與相應峰面積呈良好的線性關系。按照3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限，AA和DHAA的檢出限分別為0.015 μg/g和0.003 μg/g，按照10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量限，兩者的定量限分別為0.050 μg/g和0.010 μg/g（表1）。AA和DHAA的保留時間具有較高的重復性，日內和日間精密度以相對標準偏差（RSD）表示，結果均低于2.0%。

2.3實際樣品分析

采用已經建立的固相萃取凈化、高效液相同時分析AA和DHAA的方法，對市場上流通的肉鵝制品中松香殘留進行分析。由表2可見，市場上的生、熟肉鵝制品（各10種）中松香的陽性檢出率均高達80%，AA含量分別在2.82～14.52? μg/g和0.64～9.6? μg/g范圍；生、熟肉鵝制品DHAA的陽性檢出率分別為80%和60%，DHAA含量分別在1.62～10.06? μg/g 和0.06～2.62? μg/g范圍。這2種物質的陽性檢出率均比較高，表明市場流通領域的肉鵝制品普遍存在松香殘留情況，AA和DHAA的范圍變化比較大，可能與使用的脫毛劑中松香組成、含量分布、 脫毛工藝、加工方式等因素有關，與前期的研究結果基本一致。沈金燦等分別采用松香和松香甘油酯模擬肉鴨脫毛，結果表明這2種脫毛劑均可能導致肉鴨胴體殘留松香［11］。目前市場上流通的肉鵝制品松香殘留率較高，尚不能有效區分松香殘留的來源究竟是松香還是松香甘油酯。因此，需要更深入研究松香殘留的影響因素，確保脫毛效率的同時，減少或消除松香殘留的發生。

3結論

本研究以AA和DHAA作為松香殘留的標志物，采用固相萃取前處理、HPLC-PDA/FLR分析對市場上的肉鵝制品中松香殘留情況進行普查。該方法可以實現AA和DHAA同時分析檢測，具有操作簡單、靈敏度高等優點。市場上流通的生、熟肉鵝制品中AA的陽性檢出率均高達80%，AA含量分別在2.82～14.52? μg/g和0.64～9.6? μg/g范圍，而生、熟肉鵝制品中DHAA的陽性檢出率分別為80%和60%，DHAA含量分別在1.62～10.06? μg/g和0.06～2.62? μg/g范圍。這些殘留的松香最終被消費者攝入，具有潛在的食品安全隱患，應該引起更多的關注。

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