LncRNA H19及miRNA 130a表達水平與冠狀動脈狹窄程度的相關(guān)性分析*

翟宇新 ，張斌強，錢航，徐先琳，唐俊，王雙雙，陳繼舜

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)國藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，湖北 十堰 442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院，湖北 十堰 442008）

我國的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease,CAD）發(fā)病率及死亡率仍呈上升趨勢，是嚴(yán)重影響了人類健康的公共衛(wèi)生問題［1］。對CAD 的早期診斷以及病情評估可以改善CAD 患者的預(yù)后提高其生活質(zhì)量［2］。目前研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（LncRNA）和微小RNA（miRNAs）在心血管疾病的相關(guān)研究中具有重要地位，它們直接或間接的影響著CAD 的發(fā)生與發(fā)展［3-4］。其中長鏈非編碼RNA H19（LncRNA H19）和微小RNA 130a（miRNA 130a）通過調(diào)控多種機制參與心血管疾病的進展［5-6］。目前LncRNA H19、miRNA 130a 在血漿中的表達量與冠狀動脈狹窄程度的關(guān)聯(lián)性沒有明確的研究，因此本研究擬分析臨床患者血漿中LncRNA H19 與miRNA 130a 的表達水平的變化，探究LncRNA H19 與miRNA 130a的表達水平是否與冠脈狹窄程度存在關(guān)聯(lián)性，旨在為CAD 的早期診斷及病情判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2021 年7 月至2021 年10 月就診于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院心血管內(nèi)科且均行冠狀動脈造影（CAG）明確冠狀動脈血管情況的住院患者共92 例為研究對象，男48 例，女44 例，年齡≥18 歲，患者及家屬均知情同意。同時，院內(nèi)采集基礎(chǔ)資料及一般臨床生化指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝、腎等重要臟器功能不良者；存在行為認(rèn)知障礙等無法完成知情同意的患者；對實驗造成影響的其他血管疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 實驗分組

依據(jù)CAG 結(jié)果分為CAD 組（冠狀動脈主要血管狹窄大于50%）和對照組（非CAD 組），冠狀動脈造影根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)由二名有豐富經(jīng)驗的副主任醫(yī)師及以上職稱的醫(yī)生對冠狀動脈造影結(jié)果進行判定。根據(jù)Gensini 評分中位數(shù)［7］，將CAD 組進一步分為2 個亞組：低分組，Gensini 評分＜40 分；高分組，Gensini 評分≥40 分。

1.3 實驗方法

1.3.1 收集血液標(biāo)本 患者入院第二天清晨，收集空腹外周靜脈血5 mL，經(jīng)3 500 r/min 轉(zhuǎn)速持續(xù)離心15 min（美國Thermo Heraeus Pico 17/21 微量離心機），離心半徑10 cm，取部分上清液加Trizol混勻于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ? mL 靜脈血送檢驗科檢驗白蛋白、血尿酸、堿性磷酸酶、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 LncRNA H19 檢測將凍存血漿樣本使用 Trizol 法提取總 RNA 。使用紫外分光光度計測定 RNA 水平；設(shè)計引物正向：5′-TGCTGCACTTTACAACCACTG-3′，反向：5′-ATGGTGTCTTTGATGTTGGGC-3′，內(nèi)參使用β-actin，正向引物：5′-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3′，反向引物：5′-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3′，依照 天根科技有限公司lnRcute lncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（KR202）說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。每個樣本cDNA 取2 μL 加入天根科技有限公司lnRcute lncRNA 熒光定量檢測試劑上熒光定量PCR 儀檢測（博日實時熒光定量PCR 儀9600plus），PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 3 min，1 個循環(huán)；95℃ 5 s，50℃10 s，72℃ 15 s，40 個循環(huán)。應(yīng)用Taq-Man 探針實時定量熒光聚合鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和PCR 雙重特異引物擴增技術(shù)檢測LncRNA H19 的Ct 值。

1.3.3 miRNA 130a 檢測 取凍存血漿樣本200 μL使用miRcute miRNA 提取分離試劑盒（天根科技有限公司）分離出miRNA。使用設(shè)計成熟的miRNA 130a 的特異性引物（天根科技有限公司），并加入miRcute 增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。每個樣本cDNA 取2 μL加入天根科技有限公司miRcute 增強型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）（FP411）上熒光定量PCR 儀檢測，PCR 反應(yīng)條件為：95℃15 min，1 個循環(huán)；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40 個循環(huán)。檢測miRNA 130a 的Ct 值。

所有目的基因表達倍數(shù)按2-ΔΔCt的公式計算得到。所有反應(yīng)重復(fù)三次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的以中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（P25,P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料用頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman 檢驗分析兩變量間的相關(guān)程度和方向，取雙側(cè)檢驗；采用受試者工作特征（ROC）曲線評估相關(guān)指標(biāo)對結(jié)局的診斷價值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

通過CAD 組與對照組一般臨床資料比較可得出：兩組總膽固醇、HDL-C、LDL-C、白細胞等差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 對照組與CAD 組患者一般臨床資料比較

2.2 不同組別血漿中LncRNA H19 及miRNA 130a 的表達情況

CAD 組血漿中LncRNA H19 表達水平高于對照組，miRNA 130a 表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。依據(jù)Gensini 評分標(biāo)準(zhǔn)，將CAD 組進一步分為兩組，低分組30 例，高分組31 例，高分組血漿中LncRNA H19 表達水平高于低分組，miRNA 130a 表達水平低于低分組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2、表3。

表2 對照組與CAD 組患者血漿LncRNA H19 及miRNA 130a 表達水平比較 ［M（P25,P75）］

表3 不同Gensini 評分患者血漿LncRNA H19 及miRNA 130a 表達水平比較 ［M（P25,P75）］

2.3 血漿中LncRNA H19 及miRNA 130a 表達水平與Gensini 評分的相關(guān)性分析

根據(jù)Spearman 檢驗分析后可知，CAD 患者血漿中的LncRNA H19 表達水平與Gensini 評分呈正相關(guān)（r=0.481,P＜0.05），即LncRNA H19 表達水平越高，冠狀動脈狹窄程度越重；而miRNA 130a的表達水平與Gensini 評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.386,P＜0.05），即miRNA 130a 表達水平越低，冠狀動脈狹窄程度越重。

2.4 血漿中LncRNA H19、miRNA 130a、二者聯(lián)合對CAD 及其嚴(yán)重程度的診斷效能

LncRNA H19、miRNA 130a 以及二者聯(lián)合診斷CAD 的曲線下面積（AUC）分別為 0.685（95%CI：0.569～0.801，P＜0.05，靈敏性0.836，特異性0.452）、0.804（95%CI：0.701～0.908,P＜0.05，靈敏性0.903，特異性0.613）、0.821（95%CI：0.728～0.914,P＜0.05，靈敏性 0.918，特異性0.613）。在此基礎(chǔ)上，進一步診斷冠狀動脈狹窄程度 的AUC 分別為0.777（95%CI：0.661～0.894,P＜0.05，靈敏性0.933，特異性0.516）、0.723（95%CI：0.597～0.850,P＜0.05，靈敏性0.516，特異性0.900）、0.836（95%CI：0.733～0.938,P＜0.05，靈敏性0.774，特異性0.867）。通過比較發(fā)現(xiàn)，單獨LncRNA H19 或miRNA 130a 的AUC 值低于二者聯(lián)合的AUC 值，且靈敏性與特異性較二者單獨診斷有所提高，因此推斷二者聯(lián)合在一起具有更好評估冠狀動脈狹窄程度的效能，見圖1、圖2。

圖1 血漿中LncRNA H19、miRNA 130a 及二者聯(lián)合診斷CAD 的ROC 曲線

圖2 血漿中LncRNA H19、miRNA 130a 及二者聯(lián)合診斷冠狀動脈狹窄程度的ROC 曲線

3 討論

CAD 是臨床中常見的心血管疾病，其基礎(chǔ)病理改變是血管動脈粥樣硬化引起管腔狹窄，可以導(dǎo)致心肌缺氧缺血從而引發(fā)心絞痛，嚴(yán)重時血管閉塞，甚至可引起心肌梗死，危及患者的生命［8］。早期診斷CAD，更積極地控制其危險因素，可以改善患者預(yù)后。相關(guān)研究顯示，LncRNA 和miRNA 通過多種途徑影響著CAD 的發(fā)生發(fā)展。

Gensini 評分是目前臨床上評價冠脈狹窄程度的常用方法，冠狀動脈病變越嚴(yán)重則Gensini 評分越高。本研究顯示，CAD 組及CAD 高Gensini 評分組患者血漿中LncRNA H19 的表達高于對照組。PAN 等［9］在臨床研究中發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化的患者血清中LncRNA H19 表達含量異常。提示血漿中LncRNAH19 的表達情況可能參與CAD 的發(fā)生發(fā)展。本次研究發(fā)現(xiàn)，隨著冠脈血管狹窄程度的增加，LncRNAH19 在血漿中的表達水平逐漸升高。相關(guān)研究顯示，LncRNA H19 的過表達可以促進斑塊內(nèi)毛細血管形成，新生的毛細血管可以增加血管粥樣硬化區(qū)域的營養(yǎng)和局部的氧氣供應(yīng)，加快動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展［10-11］。在CAD 患者血清中，LncRNA H19 呈高表達，且與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平呈正相關(guān)。由此推測LncRNA H19 可能通過相關(guān)通路調(diào)控VEGF 的表達［12］。而在經(jīng)血清剝奪處理的小鼠間充質(zhì)干細胞中，加強LncRNA H19 表達可以靶向抑制miR-199a-5p，雙熒光素酶報告試驗提示VEGF 是miR-199a-5p 下游的靶標(biāo)［13］。VEGF 可以通過促進內(nèi)皮細胞增殖、提高管壁通透性、介導(dǎo)炎性細胞浸潤等多種方式增加新生血管密度，進一步加劇粥樣斑塊的不穩(wěn)定性［14］。另外有報道顯示，泡沫細胞中的LncRNA H19 過表達，可以抑制脂質(zhì)的代謝、增加脂類沉積，導(dǎo)致泡沫細胞中的脂代謝紊亂，從而加重血管粥樣硬化［15］。結(jié)合上述相關(guān)研究推測：LncRNAH19 可能通過調(diào)控斑塊內(nèi)毛細血管的生成以及脂代謝紊亂的發(fā)生參與CAD 的進展。

血管內(nèi)皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化斑塊形成的重要條件之一［16］。有報道顯示，miRNA 130a可以促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和凋亡［17］。本次研究顯示，miRNA 130a 在CAD 組血漿中的表達低于對照組，提示miRNA130a 可能參與CAD 的發(fā)生。通過Gensini 評分進一步將CAD 患者分為低分組和高分組，分析顯示，低分組、高分組血漿中miRNA 130a 的表達水平逐漸降低。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 130a 通過抑制人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/Akt）來減輕血管內(nèi)皮細胞的損傷，進而影響了CAD 的發(fā)生發(fā)展［18-19］。同時有報道稱，在脂質(zhì)沉積的小鼠網(wǎng)膜脂肪組織細胞中miRNA 130a 呈高表達，這種相對含量變化提示miRNA 130a 可能參與了脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)，并影響了冠狀動脈粥樣硬化的進程［20］。在動物實驗研究中，用miRNA 130a 抑制劑處理的年輕血管內(nèi)皮細胞會導(dǎo)致其衰老進程加快，并降低其血管生成能力。與之相反的是，在衰老的血管內(nèi)皮細胞中提高miRNA 130a 的表達水平可減緩內(nèi)皮細胞的衰老進程并改善血管生成情況［21］。內(nèi)皮細胞衰老會導(dǎo)致蛋白水解酶活性和降解速度均降低，膠原蛋白的合成和分解失衡，血管壁上膠原蛋白沉積以及彈性蛋白減少，造成冠狀動脈粥樣硬化［22］。這提示著miRNA 130a 可以通過延緩細胞衰老減緩CAD 的進程。結(jié)合本次研究推測血漿中miRNA 130a 的表達水平與冠狀動脈狹窄程度呈負(fù)相關(guān)，miRNA 130a 可參與CAD 的發(fā)展演變，在一定程度上其表達水平變化可以反映CAD 嚴(yán)重程度。

有研究表明，血清中的LncRNA H19 對CAD有一定的診斷價值［23］。本實驗結(jié)果示：LncRNA H19、miRNA 130a 以及二者聯(lián)合診斷CAD 的AUC分別為 0.685、0.804、0.821，證實血漿中LncRNA H19、miRNA 130a 對CAD 具有一定的診斷效能，而二者聯(lián)合診斷CAD 預(yù)測效能較二者單獨診斷更高。在上述結(jié)論的基礎(chǔ)上，本次研究進一步分析了血漿中LncRNA H19、miRNA 130a 以及二者聯(lián)合對冠狀動脈狹窄程度的診斷效能，實驗結(jié)果顯示LncRNA H19、miRNA 130a 以及LncRNA H19 聯(lián)合miRNA 130a 診斷冠狀動脈狹窄程度的AUC 分別為0.777、0.723、0.836。根據(jù)上述結(jié)果可以推測，LncRNA H19、miRNA 130a 可以在一定程度上診斷冠狀動脈狹窄程度，并且LncRNA H19 聯(lián)合miRNA 130a 診斷效能更高，這為CAD 的臨床診斷提供了新的思路。

綜上所述，LncRNA H19、miRNA 130a 與CAD 具有密切的關(guān)系，對于CAD 嚴(yán)重程度的早期診斷具有重大的意義。本次研究首次得出，隨著冠狀動脈狹窄程度的增加，CAD 患者血漿中LncRNA H19 的表達水平升高，而miRNA 130a 的表達水平降低。由此可以推測，LncRNA H19、miRNA 130a 可以在一定程度上診斷冠狀動脈狹窄程度，并且LncRNA H19 聯(lián)合miRNA 130a 對冠狀動脈狹窄程度診斷效能更高。這些指標(biāo)在診斷評估CAD 嚴(yán)重程度的發(fā)展中具有潛在的臨床參考價值，值得進一步研究。