雷公藤甲素對膠質(zhì)瘤的影響

陳曉宇 張 爽 石文文 支園園 張淑君

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院病理科，黑龍江哈爾濱 150001；2. 山東省煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院病理科，山東煙臺(tái) 264099；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150028

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤之一，大多數(shù)屬于惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞分裂快、浸潤性強(qiáng)，易損傷病灶周圍組織，治療難度大，預(yù)后差。而且部分腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后仍會(huì)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)，因此，急需研制出新型的抗腫瘤藥物用于臨床治療[1-2]。近年來，多項(xiàng)研究表明雷公藤甲素在乳腺癌、肺癌、宮頸癌等多種腫瘤的治療中也表現(xiàn)出較好的療效[3-9]。本研究即在體內(nèi)體外兩種水平上研究膠質(zhì)瘤中雷公藤甲素對其增殖遷移能力的影響，并探討該作用是否與mir-221 相關(guān)。該研究可能為膠質(zhì)瘤診斷與治療提供有效的標(biāo)記物、為膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲的作用機(jī)制提供有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的 基 因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）抗體購于 abclonal 公司，mir-221 購于吉瑪基因公司，雷公藤甲素購于阿拉丁公司，wistar 大鼠由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供，大鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤C6 細(xì)胞系購于普諾賽公司，-80℃超低溫冰箱來自Haier 公司，-20℃醫(yī)用低溫冰箱來自美菱公司，4℃醫(yī)用冷藏冰箱來自美菱公司，光學(xué)顯微鏡來自O(shè)lympus 公司，電泳槽來自Bio-Rad 公司，轉(zhuǎn)膜儀來自Bio-Rad 公司，PCR 試 劑 盒是SYBR Green Pro Taq HS，TAKARA公司，納米制劑由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院分子影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。本研究已通過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為wistar大鼠。本研究首先完成了大鼠的造模，并通過MRI篩選出了膠質(zhì)瘤造模成功的大鼠。本實(shí)驗(yàn)分為四組：①納米用藥組（雷公藤甲素納米給藥組注射含62.5 g的雷公藤甲素納米制劑）；②普通用藥組（注射含62.5 g 的雷公藤甲素的生理鹽水）；③生理鹽水組（注射生理鹽水）；④膠質(zhì)瘤癌旁組織組。每日記錄鼠的生存狀態(tài)。持續(xù)7 d 后再次進(jìn)行MRI 觀察。

1.2.1.2 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）檢測 收集大鼠腦組織蛋白樣品，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體等步驟進(jìn)行蛋白檢測。

1.2.1.3 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 抽提樣本的RNA，經(jīng)過純化、質(zhì)量檢測等步驟進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。PCR 引物：上游，ACACTCCAGCTGGGAGCTACATTGTCTGCTGG；下游，CTCAACTGGTGTCGTGGA。

1.2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為貼壁生長的C6 細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)分為四組：①對照組（NC組）；②低濃度用藥組（20 ng/ml）；③中濃度用藥組（55 ng/ml）；④高濃度用藥組（150 ng/ml）。每天觀察培養(yǎng)箱中細(xì)胞生長狀態(tài)及數(shù)量，顯微鏡下觀察是否污染，如果無污染，當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好且平鋪培養(yǎng)瓶超過80%時(shí)，進(jìn)行傳代處理。將細(xì)胞靜置于37℃條件下，含5%的 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8） 在96 孔板鋪板，細(xì)胞貼壁后，加不同濃度的藥物，在24、36、48 h 往孔里加CCK-8，孵育后測吸光度值。

1.2.2.3 Transwell 上下兩個(gè)小室，上室種細(xì)胞和無血清培養(yǎng)液，下室加10%血清培養(yǎng)液和藥物，24 h以后，結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞穿過上室的數(shù)量，判斷藥物對細(xì)胞遷移率的影響。

1.2.2.4 細(xì)胞劃痕 先在6 孔板鋪好細(xì)胞，待細(xì)胞長滿以后，一個(gè)培養(yǎng)孔劃三條直線，在顯微鏡下拍照記錄線的寬度。再在培養(yǎng)液里加入藥物，12 及24 h 后，在顯微鏡下拍照觀察直線的寬度變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 Graphpad Prism 軟件分析，采用t檢驗(yàn)分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 Western blot 檢測結(jié)果 大鼠成瘤后，檢測各組核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），磷酸化核因子κB（phosphorylation nuclear factor kappa-B，pNF-κB），以及PTEN 三種蛋白的表達(dá)。結(jié)果為各組中NF-κB 蛋白的表達(dá)量由高到低分別是：納米用藥組、普通用藥組、癌旁組織組、生理鹽水組，且生理鹽水組腫瘤組織中的NF-κB 蛋白含量明顯低于癌旁組織組；納米用藥組的PTEN 蛋白表達(dá)高于普通用藥組和生理鹽水組。見圖1。

圖1 Western blot 檢測不同用藥組大鼠腫瘤組織及正常癌旁組織內(nèi)各通路蛋白活化情況

2.1.2 PCR 檢測結(jié)果 本研究通過PCR 檢測不同用藥組，小鼠腫瘤組織中mir-221 的量，PCR 結(jié)果顯示納米用藥組中的mir-221 含量低于普通用藥組和生理鹽水組。見圖2。

圖2 PCR 檢測不同用藥組腫瘤組織內(nèi)mir-221 的表達(dá)水平

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 CCK-8 檢測結(jié)果 通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)測量雷公藤甲素對C6 細(xì)胞的半抑制濃度，得出24 h 的半抑制濃度約為55 ng/ml。且隨著藥物作用時(shí)間延長及藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降。見圖3。

圖3 CCK8 檢測膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞存活率在不同作用時(shí)間下隨雷公藤甲素濃度的變化情況

2.2.2 Transwell 檢測結(jié)果 Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素對C6 細(xì)胞的遷移有明顯的抑制作用，特別是中濃度組和高濃度組。見圖4。

圖4 Transwell 檢測不同濃度雷公藤甲素對膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞遷移的影響

2.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對C6 細(xì)胞的遷移在高濃度組有明顯的抑制作用，但中濃度和高濃度之間雖有差異但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度雷公藤甲素對膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞遷移的影響

2.2.4 PCR 檢測結(jié)果 雷公藤甲素同樣對miR-221的表達(dá)量有抑制作用。并且隨著藥物濃度的增加，mir-221 的相對表達(dá)量逐漸減少，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖6。

圖6 PCR 檢測不同濃度雷公藤甲素作用下，膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞內(nèi)mir-221 的表達(dá)情況

3 討論

膠質(zhì)瘤是起源于膠質(zhì)細(xì)胞常見的腦腫瘤，是原發(fā)性侵襲性腦腫瘤，流行病學(xué)上，膠質(zhì)瘤發(fā)生在所有年齡段，更常見于成人，男性比女性更易患本病。膠質(zhì)瘤患者預(yù)后嚴(yán)重不良，病死率很高，由于復(fù)發(fā)率高，且對放射治療和化學(xué)藥物治療有抵抗力，平均生存時(shí)間少于15 個(gè)月。所以基于生物標(biāo)志物準(zhǔn)確識(shí)別膠質(zhì)瘤對膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后和個(gè)性化治療具有重要意義[10-13]。那么，研究膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制以及尋找更好的給藥方式具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[14]。

近年來，由于中藥治療有助于患者恢復(fù)，提高自身的抗癌能力，減少腫瘤的再復(fù)發(fā)和再轉(zhuǎn)移，提高生存率等原因，一些具有靶向治療的中藥在腫瘤的治療中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[15-16]。其中，雷公藤作為中國的傳統(tǒng)中藥，具有活血通絡(luò)、清熱解毒等作用，目前其藥品制劑已廣泛應(yīng)用于臨床，而雷公藤甲素是其發(fā)揮作用的基本成分。其在乳腺癌中，雷公藤甲素的抗侵襲作用與抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein Kinases，ERK）信號(hào)傳導(dǎo)和NF-κB 及激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）激活有關(guān)[17]；在甲狀腺癌中，雷公藤甲素可以通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和抑制炎癥途徑來治療甲狀腺癌[18]；在肺癌中，雷公藤甲素對肺癌細(xì)胞具有放射治療增敏作用，其主要機(jī)制可能與其參與細(xì)胞凋亡及周期調(diào)控有關(guān)[19]；在非小細(xì)胞癌肺癌中，雷公藤甲素可通過抑制p21 活化激酶4（p-21-activated kinase 4，PAK4）信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)其凋亡[20]；在子宮內(nèi)膜癌中，雷公藤甲素通過誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞DNA 損傷促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用[21]；在惡性黑色素瘤中，雷公藤甲素通過上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）通路抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖及侵襲[22]。而大部分中藥抗腫瘤活性成分往往水溶性差、生物利用度低等，限制了其臨床應(yīng)用。與游離藥物相比，納米載藥系統(tǒng)表現(xiàn)出改善的生物利用度、增強(qiáng)了組織靶向性、減輕了脫靶不良反應(yīng)及更大的體內(nèi)穩(wěn)定性。

因此，本研究擬于在納米給藥的基礎(chǔ)上，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩個(gè)水平來探究雷公藤甲素對膠質(zhì)瘤的治療作用機(jī)制是否通過抑制mir-221 的表達(dá)，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲。

本研究中Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對C6 細(xì)胞的遷移有明顯的抑制作用，特別是中濃度組和高濃度組；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論一致；Western檢測結(jié)果為各組中NF-κB 蛋白的表達(dá)量由高到低分別是：納米用藥組、普通用藥組、癌旁組織組、生理鹽水組，納米用藥組的PTEN 蛋白表達(dá)高于普通用藥組和生理鹽水組；實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素對mir-221 的表達(dá)量有抑制作用。

綜上，本研究說明雷公藤甲素可能時(shí)通過抑制NF-κB 的磷酸化從而減少mir-221 的激活進(jìn)而上調(diào)抑癌基因PTEN 蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用，而且雷公藤甲素制備成納米劑型的效果可能更好。此外，雷公藤甲素可以抑制C6 細(xì)胞的遷移以及mir-221 的相對表達(dá)，可能為膠質(zhì)瘤診斷與治療提供有效的標(biāo)記物，為研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲的作用機(jī)制提供有力的理論依據(jù)。