基于網絡藥理學和分子對接技術探討澤漆湯治療非小細胞肺癌的作用機制

竇丹旎 錢韋丹

江蘇省無錫市中醫醫院藥學部，江蘇無錫 214000

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數的80%～85%[1]。國際癌癥研究機構（IARC）的報告顯示，2020 年肺癌病死率為全球第一[2]。而我國肺癌病死數超過全球總數的三分之一，成為惡性腫瘤的頭號殺手[3]。中醫認為，肺為生痰之源，脾為儲痰之器，如果肺失宣降，脾失健運，那么氣虛痰瘀則易產生腫塊，積于肺則發展為肺癌[4]。《醫宗必讀》載：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之。”也說明了氣虛是肺癌發生的根本原因[5]，因此治療應從補氣化瘀入手。

澤漆湯，出自《金匱要略》，以澤漆為君藥，佐以半夏、白前、甘草、生姜、紫參（經本草考證，此處應為拳參。拳參最早載于《神農本草經》，別名紫參，現代治療肺熱咳嗽等[6]）、黃芩、人參、桂枝，有補脾順肺、扶正化瘀之功效。現代醫學研究表明，澤漆湯對肺癌有抑制作用[7-9]。然而，澤漆湯治療NSCLC 的具體機制尚不明確。本研究用網絡藥理學預測澤漆湯治療NSCLC 的核心成分和作用靶點，并用分子對接技術進行相關驗證，為開發以澤漆湯為核心的抗肺癌新藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 澤漆湯活性成分獲取與靶點預測

利用TCMSP 數據庫檢索澤漆湯的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%以及藥物相似度（DL）≥0.18 為標準[10]，獲取活性成分與其對應的作用靶點。

1.2 NSCLC相關靶點的預測

以“non-small cell lung cancer”為關鍵詞檢索GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 以及PharmGKB 數據庫，將檢索結果合并去重，得到NSCLC 相關靶點。

1.3 “活性成分-靶點-疾病”網絡的構建

利用線上繪圖工具網站繪制藥物靶點與NSCLC 相關靶點的Venn 圖，以確定澤漆湯與NSCLC的共同靶點；將共同靶點導入Cytoscape 3.8.0 軟件中，構建“活性成分-靶點”網絡。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡分析

將共有靶點導入String 數據庫，將物種設置為人，以結合評分≥0.9 為篩選條件，將所選靶點導入Cytoscape 3.8.0 軟件，獲得PPI 網絡圖。篩選出度值排名前10 的靶點，繪制核心靶點網絡圖。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

在DAVID 數據庫中導入共有靶點，進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，以P＜ 0.05 為篩選標準。

1.6 分子對接

通過TCMSP 數據庫下載澤漆湯核心活性成分的3D 結構mol2 文件，利用RCSB PDB 數據庫下載核心靶點大分子的PDB 文件。利用AutoDock 軟件進行分子對接，選取結合能最低的構象，然后通過PyMOL 軟件繪制出分子對接3D 結合圖[15]。

2 結果

2.1 澤漆湯活性成分獲取與靶點預測

通過TCMSP 和文獻檢索，設置篩選條件為OB ≥30%且DL ≥0.18，將得到結果去除重復后，共獲得178 個澤漆湯活性成分，272 個潛在作用靶點。

2.2 NSCLC相關靶點的獲取

檢索GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 以及PharmGKB 數據庫，將結果合并去重，獲得2898 個NSCLC 疾病相關靶點。

2.3 “活性成分-靶點-疾病”網絡分析

通過Venn 圖得到藥物-疾病共有靶點189 個，見圖1。將藥物活性成分與藥物-疾病共有靶點導入Cytoscape 3.8.0 軟件，構建“活性成分-靶點”網絡圖，見圖2。網絡圖中含222 個節點、209 條邊，節點越大代表活性成分與靶點關聯度越高，其中度值排名前5 的活性成分為槲皮素、木犀草素、柚皮素、甘草醇、松柏苷。

圖1 澤漆湯活性成分和NSCLC 靶點的Venn 圖

圖2 “活性成分-靶點”網絡

2.4 藥物-疾病共有靶點PPI網絡構建

將藥物-疾病共有靶點上傳至String 數據庫，得到藥物-疾病共有靶點的PPI 網絡。其中包含188 個節點，951 條邊，平均節點度10.1。把得到的PPI 網絡數據導入Cytoscape 3.8.0 軟件中，繪制PPI網絡圖，見圖3。節點越大、線條越粗代表靶點作用關系越強。由圖可知，TP53、MAPK3、JUN、AKT1、STAT3 作用關系最強。

圖3 PPI 網絡圖

2.5 GO、KEGG通路富集分析結果

利用David 數據庫對189 個常見藥物疾病靶點的GO功能進行分析，得到505個GO條目（P＜ 0.05），其中生物過程（BP）389 個，細胞成分（CC）36 個，分子功能（MF）80 個。對每個類別的前10 項進行可視化分析，見圖4。在BP 中，涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、DNA 模板轉錄的正調控、凋亡過程的負調控等；在CC 中，包括胞質溶膠、細胞核等；在MF 中，涉及蛋白質結合、酶結合等。

圖4 GO 功能富集分析

KEGG 通路富集分析得到癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE 信號通路等相關信號通路，選取排名前10 位的信號通路作氣泡圖，見圖5。

圖5 KEGG 通路富集分析

2.6 分子對接

分子對接結果顯示，槲皮素、木犀草素等核心成分與TP53、MAPK3 等核心靶點均存在結合位點，結合能越小，表明結合越容易，排名前5 位的為MAPK3 與柚皮素、MAPK3 與甘草醇、AKT1 與松柏苷、MAPK3 與木犀草素、MAPK3 與松柏苷，其相應的對接構象見圖6。

圖6 澤漆湯活性成分與關鍵靶點的分子對接情況

3 討論

NSCLC 占肺癌總數的85%左右，其發病率和病死率均居全球首位[11]。因其存在治療難、易復發等問題[12]，所以新的治療方式亟待開發。中醫認為，肺癌病機多為虛證氣滯，然后出現水停、痰凝、痰血瘀等，最終形成腫瘤[13]。澤漆湯能益氣養陰、理氣化痰、祛瘀散結、解毒抗癌。現代研究[14]也表明，澤漆湯對肺癌模型小鼠有顯著的抑制作用。

本研究通過TCMSP 數據庫檢索澤漆湯成分，以獲得其有效成分并預測潛在靶點，包括TP53、MAPK3、STAT3 等。TP53 是重要的腫瘤抑制因子，研究表明，超過半數的人類腫瘤中都存在TP53 的突變或缺失[15]。MAPK3 與STAT3 均在細胞凋亡等病變過程中有參與。本研究結果提示澤漆湯可能通過調控上述靶點來抑制NSCLC 腫瘤細胞的分裂和增殖。

GO 功能富集分析結果顯示，澤漆湯通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、細胞因子介導的信號通路、DNA 模板轉錄的正調控、凋亡過程的負調控等生物過程，在胞質溶膠、細胞核等細胞組分中，通過影響蛋白質結合、酶結合等分子功能來治療NSCLC。KEGG 通路富集分析結果顯示澤漆湯通過作用于癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE 信號通路等相關信號通路治療NSCLC。

本研究采用分子對接技術驗證澤漆湯核心活性成分與關鍵靶點的結合能力，結果表明，活性成分與關鍵靶點之間存在結合位點，最小結合能為-6.08 kJ/mol，存在氫鍵等分子間結合力。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學和分子對接技術，預測了澤漆湯治療NSCLC 的物質基礎和作用機制，為后期開發以澤漆湯為主的抗肺癌新藥研究提供了理論依據。