人促紅素中二聚體及高分子量物質的質量研究

唐 娜 賈麗華 宋 莉 陳統華 蘇超男 王嫦鶴

陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西西安 710065

人促紅素是用基因重組技術構建CHO 細胞，高效表達并且能刺激紅細胞生成的糖蛋白，臨床用于腎功能不全所致貧血、非骨髓惡性腫瘤化療引起的貧血、外科圍手術期紅細胞動員等癥狀的治療[1-6]。高分子量物質是在藥物生產和貯存過程中產生的高分子聚合物，在臨床中會引起不良反應，也是引起過敏反應的主要原因[7-10]。

《中華人民共和國藥典》2020 年版三部并未對人促紅素原液及注射液的二聚體及高分子量物質進行控制[11]，為確保臨床用藥的安全性，保證藥品的質量，從質量控制角度需增加高分子量物質檢查項，本研究參照《英國藥典》[12]和《歐洲藥典》[13]的方法，建立了體積排阻色譜法測定人促紅素原液中的二聚體及高分子量物質，并進行了方法學驗證，表明該方法專屬性強，靈敏度高，可為人促紅素原液及注射劑中二聚體和高分子量物質的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 主要試劑及儀器

無水磷酸氫二鈉（批號：20210528）、磷酸二氫鉀（批號：20210530）氯化鈉（批號：20220616）均購自國藥集團化學試劑有限公司。水為高純水。色譜柱TSKgel G3000SW（7.5 mm×60 cm，10 μm）。Waters/Arc 高效液相色譜儀及Empower 工作站，梅特勒S220 酸度計，梅特勒公司XPR205 電子分析天平。

1.2 供試品及對照品

共收集到9 家國內生產企業（企業A ～I）的人促紅素原液共計24 批；處方中不含人血白蛋白的人促紅素注射液3 批，其中來自1 家國內生產企業（企業D）的人促紅素注射液2 批（D4 和D5），1 家進口生產企業（企業J）的人促紅素注射液1 批。EPO-SEC CRS 歐洲標準品（歐洲藥品和保健質量理事會，批號：00VdTS）。

1.3 色譜條件

采用TSKgel G3000SW 色譜柱；流動相為磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鉀0.2 g、無水磷酸氫二鈉1.2 g 和氯化鈉23.5 g，加水溶解并稀釋成1000 ml，調節pH 值至7.4）；流速為0.5 ml/min；檢測波長為214 nm；進樣量為50 μl；柱溫為30℃；樣品池溫度為8℃；保留時間為單體峰保留時間的2 倍。系統適用性要求二聚體與單體峰之間的分離度應＞1.5。對照品溶液的單體峰面積為分離度溶液單體峰面積的1.5%～2.5%。

1.4 溶液的配制方法

1.4.1 供試品溶液的配制 取供試品，按照供試品的蛋白質含量用流動相稀釋制成含蛋白0.4 mg/ml的溶液，混勻，作為供試品溶液。

1.4.2 分離度溶液 取EPO-SEC CRS 歐洲標準品1 瓶（蛋白含量100 μg），精密加入250 μl 流動相，用流動相溶解并稀釋制成0.4 mg/ml 溶液，作為分離度溶液。

1.4.3 對照品溶液 精密量取分離度溶液20 μl，加980 μl 流動相稀釋制成0.008 mg/ml 溶液，混勻，作為對照品溶液。

2 結果

2.1 系統適用性

精密量取分離度溶液和對照品溶液各50 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定分離度和峰面積比。結果顯示單體峰的保留時間約為30 ～35 min。對照品溶液的單體峰面積為分離度溶液單體峰面積的1.5%～2.5%，分離度溶液中二聚體與單體峰之間的分離度均大于1.5，見圖1，表明方法適用性良好。

圖1 HPLC 色譜圖

2.2 專屬性

根據生產企業的工藝處方，取枸櫞酸、枸櫞酸鈉、氯化鈉等輔料適量，配制輔料空白，稱取適量，用流動相溶解并過濾，作為輔料空白溶液。取輔料空白溶液、流動相和對照品溶液各50 μl，分別注入液相色譜儀，按照“1.3”項下的方法進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示各輔料在主峰出峰位置均無干擾峰，見圖1，表明方法專屬性良好。

2.3 重復性

取同一批人促紅素原液，按照“1.4.1”項下配制6 份供試品溶液，按照“1.3”項下的方法進樣分析，記錄色譜圖。二聚體及高分子量物質含量的RSD 為1.95% ，見表1，表明方法的重復性良好。

表1 重復性測定結果

2.4 檢測限

取對照品溶液，加流動相逐步稀釋，按照“1.3”項下的方法進樣分析，考察檢測限。以信噪比S/N ≥3為檢測限，結果顯示S/N 約為3.4，單體峰濃度為0.002 mg/ml 為檢測限。

2.5 穩定性

取同一批人促紅素原液，按照“1.3”和“1.4”項下的方法，制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進樣分析，記錄色譜圖。峰面積的RSD 值為0.92%，見表2，結果表明供試品溶液在24 h 內穩定。

表2 穩定性測定結果

2.6 樣品的測定

取24 批人促紅素原液和3 批人促紅素注射液，按照“1.4.1”項下制備供試品溶液，按照“1.3”項下的方法進樣分析，記錄色譜圖。24 批人促紅素原液和3 批人促紅素注射液二聚體及高分子量物質的測定結果分析見圖2。結果表明除2 個企業的原液未檢出外，其余各廠家的原液均有檢出，按面積歸一化法計算二聚體及高分子量物質的含量均在2.0%以下。3 批人促紅素注射液均未檢出。其中企業D 的原液和注射液均未檢出二聚體及高分子量物質，企業I 原液的二聚體及高分子量物質的含量最高。見圖2。

圖2 各企業原液中二聚體及高分子量物質統計圖

3 討論

本研究收集了9 家生產企業和1 家進口企業的人促紅素原液和注射液共計27 批樣品，我國批準的人促紅素注射劑（包括注射用和注射液）涉及11 家國內生產企業，本研究收集到的樣品共涉及9 家國內生產企業，1 家進口生產企業，樣品涵蓋了82%的國內生產企業；從數據的結果來看，不同企業的生產工藝不同，可能會導致其產品中二聚體及高分子量物質的殘留量的差異，其中企業I 的人促紅素原液樣品二聚體及高分子量物質含量最高，應引起重視，從生產工藝等各環節考察產生二聚體及高分子量物質的原因。因此有必要從源頭開始進行嚴格的控制，以保證最終注射液產品的安全。建議在人促紅素原液標準中增加二聚體及高分子量物質的檢查項，參照《英國藥典》和《歐洲藥典》的限度要求，將該項目的限度暫定為2.0%。

高分子量物質在臨床使用中會引起不良反應，是引起過敏反應的主要原因[14-18]，有必要在標準中進行控制。目前尚無文獻報道人促紅素中的二聚體及高分子量物質的測定方法。藥品中二聚體的檢測方法大多采用排阻色譜法進行測定。現行標準《中華人民共和國藥典》2020 年版三部和各個企業的標準均未對人促紅素原液的二聚體及高分子量物質進行控制，本研究采用體積排阻色譜法增加了系統適用性試驗要求，能夠有效地控制人促紅素原液中的二聚體及高分子量物質的含量，該方法操作簡便、快捷，靈敏度高，重現性好。

綜上所述，本研究建立了體積排阻色譜法測定人促紅素原液中的二聚體及高分子量物質的方法，能夠有效控制人促紅素原液中的二聚體及高分子量物質的含量，嚴把質量標準關，保證用藥安全。