右美托咪定對缺氧/復氧心肌細胞的保護作用及機制研究

汪艷萍, 許宜珍, 袁應川, 古麗·亞科夫, 陳政文, 陳愛芳

(新疆醫科大學第二附屬醫院 麻醉科, 新疆 烏魯木齊, 830063)

麻醉過程中的缺氧是心肌缺血最重要的病因,可誘發心肌細胞凋亡、氧自由基的累積等,進而導致細胞死亡,引發心肌梗死。因此,如何保護麻醉過程中心肌細胞損傷成為研究的重點。右美托咪定(Dex)是近年來出現的高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑,具有鎮靜、鎮痛和抗焦慮功效,對人體呼吸功能抑制性較弱,代謝快,不良反應少[1]。臨床研究[2]發現, Dex可顯著減少術后心肌缺血再灌注損傷發生率,提示Dex對心臟具有保護功能。張瑩瑩等[3]研究發現,心臟瓣膜置換術中使用Dex可保護心肌功能。此外,動物實驗[4-5]同樣表明,Dex可保護缺氧-復氧心肌細胞。但Dex對心肌細胞的保護作用機制尚處于探索階段。微小RNA(miRNA)參與細胞的多種生物學行為,研究[6-7]發現,miRNA修復缺氧/復氧心肌細胞損傷中發揮重要作用。研究[8]顯示,慢性心力衰竭患者血漿miR-138-5p水平呈低表達,上調miR-138-5p可促進缺氧/復氧心肌細胞的增殖,抑制凋亡。然而, miR-138-5p調控缺氧/復氧心肌細胞損傷的機制及其與Dex的關系尚不清楚。本研究探討了Dex對缺氧/復氧心肌細胞的保護作用及其對miR-138-5p的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器

H9C2心肌細胞(蘇州海星生物科技有限公司),鹽酸右美托咪定(天津一方科技有限公司),DMEM/F12培養基、雙抗、胎牛血清(南京森貝伽生物科技有限公司),細胞凋亡檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)酶聯反應檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)酶聯反應檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司),CCK-8檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司),兔抗人白細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl相關X蛋白(Bax)一抗(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司),二甲基亞砜(DMSO)(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司),Mir-X miRNA First-Strand Synthesis試劑盒(日本takara公司),TRIzol(上海聯邁生物工程有限公司),空質粒(Vector)、miR-138-5p mimic、突變型(MUT)-性別決定區Y框蛋白9(SOX9)、野生型(WT)-SOX9載體(沈陽萬通生物有限公司),Lipofectamine 3000(上海傳秋生物科技有限公司),螢光素酶報告基因酶法試劑盒(Luciferase Reporter Gene, 上海西唐生物科技有限公司), ABI7500PCR儀(美國ABI公司),多功能酶標儀(杭州優米儀器有限公司), Tanon V8快速蛋白質印跡系統(武漢華科達實驗設備有限公司)。

1.2 細胞培養、分組

H9C2細胞使用完全DMEM/F12培養基(包含0.1%雙抗、10%胎牛血清)進行培養,培養條件為37 ℃、5% CO2。待細胞融合到80%左右時進行傳代,取傳代3次的細胞進行后續實驗。將正常培養的細胞設為對照組。H9C2 細胞首先用無血清DMEM/F12培養基在95% N2+5% CO2的條件下孵育2 h,然后使用完全DMEM/F12培養基, 37 ℃、5% CO2條件下孵育6 h, 最后培養成缺氧/復氧(H/R)細胞。

用含有10 nmol/L Dex的完全DMEM/F12培養基孵育 H9C2細胞 24 h,然后進行H/R處理,將其設定為H/R+Dex組。將Vector、miR-138-5p mimic質粒轉染至H9C2細胞后進行H/R處理,分別設定為H/R+Vector組、H/R+miR-138-5p組。將Vector、miR-138-5p mimic質粒分別與MUT-SOX9、WT-SOX9載體結合,共同轉染至H9C2細胞,將得到的轉染細胞分為MUT-SOX9+Vector組、MUT-SOX9+miR-138-5p組、WT-SOX9+Vector組及WT-SOX9+miR-138-5p組。

1.3 酶聯免疫反應吸附法(ELISA)檢測上清液指標水平

收集各組細胞上清液,以2 000轉/min離心5 min,將上清液轉移至新的離心管中。按照試劑盒說明書檢測上清液中MDA、SOD、LDH、TNF-α及IL-6含量。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖

將各組細胞接種到96孔(1 000個細胞/孔),并進行不同處理24 h后加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h, 檢測450 nm吸光度值。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

各組細胞培養24 h后用胰酶消化,制備單細胞懸液(2×105個/mL), 然后分別加入5 μL Annexin V-FITC、氯化丙定(PI),避光孵育15 min。上機檢測細胞凋亡率。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測miR-138-5p表達

向各組細胞中加入Trizol提取總RNA, 利用反轉錄試劑盒合成 cDNA, 體系如下: mRQ Buffer (2x) 5 μL, RNA sample 3.75 μL, mRQ Enzyme 1.25 μL, 總體積10 μL, 隨后進行qRT-qPCR,體系如下: ddH2O 9.0 μL, TB Green Advantage Premix (2X) 12.5 μL, ROX Dye (50X) 0.5 μL, miRNA-specific primer (10 μmol/L)及mRQ 3′ Primer (10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA 2.0 μL。反應條件: 95 ℃ 10 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 20 s, 95 ℃ 60 s, 55 ℃ 30 s, 95 ℃ 30 s。內參選擇U6, 采用2-△△Ct法表示miR-138-5p相對表達量。miR-138-5p上游引物: 5′- CCGATAAGACGAACAA-3′, 下游引物: 5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′; U6上游引物: 5′-GTTGCGGGTGTCCGAATG-3′, 下游引物: 5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′。

1.7 Weston blot檢測TNF-α、IL-6、Bcl-2、Bax及SOX9的表達

使用RIPA提取細胞總蛋白,測量濃度。配制濃縮膠、分離膠后向槽中加入約20 μg的蛋白, 70～110 V下分離蛋白,然后將蛋白轉移只PVDF膜上,5%脫脂牛奶常溫下封閉1 h, 加入TNF-α(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)及SOX9(1∶1 000), 4 ℃冰箱孵育過夜,次日加入對應的二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h, 曝光, Image J分析灰度值,使用目的蛋白/內參β-actin比值表示表達量。

1.8 熒光素酶報告實驗

通過target網站(http://www.targetscan.org)分析miR-138-5p與SOX9基因的結合核苷酸序列。將miR-NC、miR-138-5p mimic與MUT-SOX9、WT-SOX9分別兩兩結合共同轉染至H9C2細胞中,孵育48 h, 使用細胞裂解液裂解后保留上清液檢測熒光素酶活性。

1.9 統計學方法

使用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析,計量數據以均數±標準差表示,組間比較行t檢驗,多組間單因素方差分析比較行q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Dex對H/R細胞增殖的影響

H/R組細胞吸光度值為(0.83±0.07), 低于對照組的(2.01±0.13), 差異有統計學意義(t=13.84,P<0.001); H/R+Dex組細胞吸光度值為(1.68±0.11), 高于H/R組,差異有統計學意義(t=11.29,P<0.001)。

2.2 Dex對H/R細胞凋亡的影響

H/R組細胞凋亡率、Bax蛋白表達量分別為(19.93±2.03)%、(0.93±0.07), 高于對照組的(5.14±0.21)%、(0.89±0.11), Bcl-2蛋白表達量為(0.21±0.04), 低于對照組的(0.46±0.08), 差異有統計學意義(P<0.001); H/R+Dex組細胞凋亡率、Bax蛋白表達量分別為(8.32±0.53)%、(0.31±0.03), 低于H/R組, Bcl-2蛋白表達量為(0.78±0.09), 高于H/R組,差異有統計學意義(P<0.001)。見圖1。

A: 對照組典型凋亡圖; B: H/R組典型凋亡圖; C: H/R+Dex組典型凋亡圖; D: 各組細胞凋亡相關蛋白表達。圖1 各組細胞凋亡率、Bcl-2及Bax表達量比較

2.3 Dex對H/R細胞炎性因子、MDA、SOD、LDH表達的影響

H/R組細胞MDA、LDH、TNF-α、IL-6表達量高于對照組, SOD表達量低于對照組,差異有統計學意義(P<0.001); H/R+Dex組細胞MDA、LDH、TNF-α、IL-6表達量低于H/R組, SOD表達量高于H/R組,差異有統計學意義(P<0.001)。見表1、2。

表1 各組細胞MDA、SOD、LDH表達水平比較

表2 各組細胞炎性因子和蛋白表達水平比較

2.4 Dex對H/R細胞miR-138-5p、SOX9表達的影響

表3 各組細胞miR-138-5p、SOX9表達水平比較

H/R組細胞SOX9蛋白表達量高于對照組, miR-138-5p表達量低于對照組,差異有統計學意義(P<0.001); H/R+Dex組細胞SOX9表達量低于H/R組, miR-138-5p表達量高于H/R組,差異有統計學意義(P<0.001)。見表3。

2.5 miR-138-5p對H/R細胞增殖的影響

H/R+miR-138-5p組細胞miR-138-5p表達量為(1.65±0.15), 吸光度值為(1.64±0.13), 分別高于H/R+Vector組的(0.13±0.03)、(0.83±0.07), 差異有統計學意義(t=17.21, 9.502,P<0.001)。

2.6 miR-138-5p對H/R細胞凋亡的影響

H/R+miR-138-5p組細胞凋亡率為(5.14±0.21)%, Bax蛋白表達量為(0.41±0.11), 分別低于H/R+Vector組的(19.88±4.05)%和(0.95±0.13), Bcl-2表達量為(0.43±0.12), 高于H/R+Vector組的(0.14±0.04), 差異均有統計學意義(P<0.001)。見圖2。

A: H/R+Vector組典型細胞凋亡圖; B: H/R+miR-138-5p組典型細胞凋亡圖; C: 2組細胞凋亡相關蛋白表達。圖2 2組細胞凋亡率、Bcl-2蛋白及Bax表達量比較

2.7 miR-138-5p對H/R細胞炎性因子、MDA、SOD、LDH表達的影響

H/R+miR-138-5p組細胞MDA、LDH、TNF-α、IL-6表達量低于H/R+Vector組, SOD表達量高于H/R+Vector組,差異有統計學意義(P<0.001)。見表4、5。

表4 2組細胞MDA、SOD、LDH表達水平比較

表5 2組細胞炎性因子和蛋白表達水平比較

2.8 miR-138-5p與SOX9的靶向關系

生物信息學分析發現, miR-138-5p與SOX9 3′UTR存在互補配對堿基對。H/R+miR-138-5p組細胞SOX9表達量低于H/R+Vector組,差異有統計學意義(P<0.05)。

與WT-SOX9+Vector組比較, WT-SOX9+miR-138-5p組細胞SOX9表達量降低,差異有統計學意義(P<0.05); MUT-SOX9+Vector組與MUT-SOX9+miR-138-5p組細胞SOX9表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

A: miR-138-5p與SOX9 3′UTR互補配對堿基; B: 熒光素酶活性實驗; C: SOX9蛋白表達量。?P<0.05。圖3 miR-138-5p與SOX9的靶向關系

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷嚴重影響患者的生命質量,嚴重時甚至引起患者死亡。Dex作為α2腎上腺素能受體激動劑,具有鎮靜、消炎等功能。研究[9-10]表明, Dex對多種器官具有保護作用。李曉濱等[11]研究發現, Dex通過調控miR-146a/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞內質網應激、氧化應激及凋亡,促進增殖。此外, WANG Z等[12]研究發現, Dex通過miR-208b-3p/Med13/Wnt通路抑制缺氧/復氧心肌細胞凋亡,促進細胞增殖。但Dex保護缺氧心肌細胞的機制尚不明確。本研究通過構建H/R心肌細胞模型,觀察Dex對心肌細胞的保護功能及機制,結果顯示, H/R心肌細胞增殖受到抑制、發生凋亡,加入Dex后則可以促進細胞的增殖并抑制凋亡,提示Dex對H/R心肌細胞具有保護作用。炎癥反應是缺血再灌注損傷的基礎。TNF-α、IL-6作為重要的促炎因子,參與了心肌細胞的缺血再灌注損傷,抑制炎癥反應可顯著改善心肌細胞的生理功能[13]。本研究結果顯示, H/R心肌細胞TNF-α、IL-6表達明顯升高,而Dex處理可抑制這些炎癥因子的表達,提示Dex可通過降低H/R心肌細胞的炎癥反應改善細胞損傷。氧化應激在心肌損傷中起到關鍵作用,心肌細胞發生損傷后,炎性因子、氧化應激反應可誘發線粒體功能失調,引起細胞內活性氧的產生,細胞出現凋亡[14]。SOD、MDA和LDH是評估抗氧化系統狀態的可靠指標,其中SOD可抑制細胞脂質過氧化反應,導致活性氧下降; 細胞損傷后MDA和LDH出現過表達,并釋放至細胞外。本研究結果顯示, Dex可降低MDA和LDH水平,提高SOD含量,提示Dex具有抗氧化應激的作用[15]。

miR-138-5p與細胞炎癥反應有關,參與心臟、腦血管及脊髓損傷的修復[16-18]。SUN S等[19]研究發現,下調miR-138-5p通過沉默調節蛋白1(SIRT1)促進心力衰竭的進展。此外, miR-138-5p在H/R心肌細胞中呈低表達,沉默miR-138-5p可上調心肌細胞炎性因子表達,促進細胞凋亡[20]。劉青[21]研究顯示, miR-138-5p在H2O2誘導H9C2心肌細胞中呈低表達,上調miR-138-5p可抑制細胞炎性因子表達及氧化應激反應。本研究結果顯示, H/R心肌細胞中miR-138-5p低表達,上調miR-138-5p可抑制H/R心肌細炎性因子表達,抑制細胞凋亡,促進細胞增殖[21]。此外,研究結果還表明,Dex處理H/R心肌細胞后可上調miR-138-5p表達,提示Dex可能通過miR-138-5p發揮其對心肌細胞的保護作用。

miRNA一般通過與下游靶基因結合發揮作用,為探索miR-138-5p的下游靶基因,本研究采用生物信息學分析法對其進行分析,結果發現miR-138-5p與SOX9 3′UTR區域存在結合位點,提示兩者可能存在靶向關系。SOX9屬于SOXE家族成員,參與細胞的多種生物學行為。研究[22]發現,在缺血性心臟疾病心肌組織中SOX9表達上調。本研究結果表明, H/R心肌細胞中SOX9高表達,與一項研究[22]結果基本一致。此外,上調miR-138-5p的心肌細胞中SOX9呈低表達,雙熒光素酶實驗進一步證實, miR-138-5p與SOX9存在負性調控關系。這些結果證實, miR-138-5p通過負性靶向調控SOX9保護H/R心肌細胞。

本研究存在一定局限性: 首先, miR-138-5p、SOX9與心肌缺血再灌注損傷的關系有待進一步在體內、體外進行實驗驗證;其次, Dex對心肌缺血再灌注損傷的保護作用有待進一步動物、人體實驗進行驗證;最后, Dex是否對通過其他miR發揮其保護作用需要進一步探討。

綜上所述, Dex可通過上調miR-138-5p抑制靶基因SOX9的表達,從而減輕H/R心肌細胞的炎癥反應及氧化應激,抑制細胞凋亡,促進細胞增殖,最終發揮保護心肌的作用。