基于數據挖掘及網絡藥理學分析辛夷-蟬蛻藥對治療兒童過敏性鼻炎的分子機制

周 珊，普 芳，張值偉，趙 蘭，唐 彥

（云南中醫藥大學第一臨床醫學院，云南 昆明 650051）

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）在現代醫學中被認為是機體接觸變應原后主要由特異性免疫蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導的鼻黏膜非感染性炎癥[1]，故又稱之為變應性鼻炎，在中醫學中屬于“鼻鼽”范疇，其具有發病率高、不易根治的特點[2]。在中醫學上，小兒鼻鼽的主要病因為正氣虛弱、外邪入侵，與氣候、地域、體質關系密不可分，病位主要在肺脾腎，病機多以本虛標實為主[3]。

蟲類藥因其具有搜風、通絡、活血化瘀之功，成為治療鼻鼽的常用藥[4-5]。現代藥理研究發現蟬蛻、地龍、僵蠶等蟲類藥具有抗過敏的功效，廣泛應用于過敏性疾病的治療中[6-10]。故深入研究含蟲類藥物組方核心藥對治療過敏性鼻炎的分子機制將更有利于其臨床應用。

本研究通過收集治療兒童AR 的含蟲類藥物組方，并運用數據挖掘手段以及網絡藥理學研究的科學方法，發掘蟲類藥物治療兒童AR 的物質基礎和分子機制，并期望為相應的實驗研究和臨床應用提供理論基礎和研究思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源 以“小兒過敏性鼻炎”“小兒變應性鼻炎”“兒童過敏性鼻炎”“兒童變應性鼻炎”“小兒鼻鼽”為初步搜索詞，查找2000—2022 年中國學術期刊全文數據庫（CNKI）內的論文，獲取與小兒AR 有關的研究論文。以“中醫”“中西醫結合”“中藥”“蟲類藥物”“治療”等為檢索關鍵詞，進行二次檢索，以獲取含蟲類藥物組方防治兒童AR 的有關論文。

1.2 納入標準 ①中醫治療兒童AR 的醫學研究成果及個人的經驗總結的論文。②論文中治療兒童AR的內服藥物方劑中含有蟲類藥。③不限劑型。④對同一人撰寫內容基本相同的論文，取其藥物組成相對詳備的論文。

1.3 排除標準 ①動物實驗、理論研究、綜述類的論文。②藥物組成不明確的論文。③疾病預防用藥或誤診用藥論文。

1.4 數據的整理與錄入 通過初步的文獻檢索與篩選之后，可獲得含蟲類藥物組方治療兒童AR 的文獻97 篇，共獲得含蟲類藥物組方102 個，其中重復處方13 個，最終納入處方89 個。錄入數據時，涉及到的中藥參照《中華人民共和國藥典（2020 版）》[11]及全國中醫藥行業高等教育“十三五”規劃教材《中藥學》[12]統一規范名稱，如：“蟬衣、蟬殼、蟲退”統一為“蟬蛻”，“雙花”統一為“金銀花”，“南豆花”統一為“扁豆花”等，并對藥物名稱進行規范化處理。

1.5 數據挖掘 運用古今醫案云平臺網頁版，將89個含蟲類藥物組方數據輸入“醫案管理”中的“分析池”，組方信息數據由兩人共同錄入并核對。然后將數據進行用藥配伍規律分析，利用藥物頻數分析、藥物關聯分析，發現核心藥對。

1.6 藥對成分收集 將1.5 中發現的核心藥對，即辛夷-蟬蛻，作為研究對象，并通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）查詢辛夷-蟬蛻所有活性成分，并依據藥代動力學參數（ADME）：辛夷口服利用度OB≥30%，蟬蛻口服利用度OB≥20%，藥物相似性（DL）≥0.18，由此作為化合物分子的篩選條件，篩選出藥物中的有效化學成分。

1.7 藥對靶點收集 通過藥物中有效成分的MOL ID 檢索TCMSP 數據庫中有效成分對應的藥物作用靶點名稱。基于藥物作用靶點名稱通過UniProt 數據庫（http：//www.uniprot.org/）查找UniProt KB 中其所對應的UniProt ID 和基因名稱，由此構建藥物有效成分-靶點基因數據庫。

1.8 疾病靶點收集 使用“allergic rhinitis”作為關鍵詞，在GeneCards 數據庫（http：//www.genecards.org/）和TTD 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd）檢索及篩選靶點基因，找到AR 的疾病潛在靶點基因。

1.9 基因映射 將AR 的疾病潛在靶點基因與核心藥對靶點基因，輸入Venn Diagrams 系統（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）通過制作疾病藥物的韋恩圖，可以檢測出交集靶點基因，即核心藥對與AR 的聯合影響的靶點基因，是藥對治療疾病的靶點基因。

1.10 核心藥對成分-疾病靶點復合網絡的構建 將1.9 中獲得的交集靶點基因輸入到Cytoscape 3.8.0（www.cytoscape.org）軟件，以形成核心藥對治療AR成分-靶點網絡圖。

1.11 PPI 網絡構建及核心靶基因篩選 將交集靶點基因提交至STRING 11.5 數據庫（http：//stringdb.org），屬性選擇為人類，篩選評分≥0.4 構建辛夷-蟬蛻治療AR 的靶基因蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖。使用Cytoscape 3.8.0 軟件對網絡進行拓撲結構分析，通過degree 值測試出核心靶基因。

1.12 GO 富集分析與KEGG 信號通路分析 通過Metascape（http：//metascape.org）對1.6 中篩選出的核心靶點進行基因生物過程（GO）富集分析與信號通路（KEGG）富集分析，生物過程（GO）富集分析包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及細胞組分（cellular component，CC）3個功能層次。使用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn）對結果實現可視化管理。根據P 值篩選出核心藥對治療AR 的靶點的GO、KEGG 過程，進而明確該藥對治療AR 的影響機理。

2 結果

2.1 藥物頻數分析 納入統計的97 篇文獻中含有89 個處方，共計156 味藥物，其中使用頻數較高的前16 味藥物為辛夷、蟬蛻、防風、甘草、白芷、蒼耳子、黃芪、白術、黃芩、烏梅、細辛、僵蠶、地龍、麻黃、五味子、茯苓，頻數均在20 次以上，使用率達22.47%以上。見表1。

表1 含蟲類藥物組方治療兒童AR 的藥物頻數統計

2.2 藥物關聯分析 對使用頻次≥20 次的藥物進行關聯規則分析后，建立支持度≥0.20，置信度≥0.50的藥物組合。結合頻數統計及關聯規則結果分析，可確定辛夷-蟬蛻為含蟲類組方治療兒童AR 的核心藥對。見表2。

2.3 辛夷-蟬蛻主要成分及靶點的篩選 通過檢索TCMSP 數據庫中辛夷-蟬蛻所有活性成分，在設置藥代動力學參數后所獲得的活性成分分別為辛夷15個、蟬蛻3 個，去除重復值，得到辛夷-蟬蛻藥對含有有效成分18 個。基于有效成分的MOL ID 在TCMSP數據庫中檢索到其對應的藥物作用靶點分別為辛夷34 個、蟬蛻27 個，通過去除重復靶點后得到辛夷-蟬蛻藥對的作用靶點52 個。

2.4 辛夷-蟬蛻與過敏性鼻炎共有靶點的篩選 將“allergic rhinitis”作為關鍵詞，分別在GeneCards（http：//www.genecards.org）及TTD 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd）檢索后獲得過敏性鼻炎相關疾病靶點，通過去重后得到1 954 個疾病靶點。將1 954 個疾病靶點與52 個辛夷-蟬蛻藥對的作用靶點數據輸入jvenn 系統（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）在線制作疾病藥物韋恩圖，獲得辛夷-蟬蛻藥對與過敏性鼻炎共有靶點11 個。見圖1。

圖1 辛夷-蟬蛻藥對與過敏性鼻炎共有靶點韋恩圖

2.5 辛夷-蟬蛻治療AR 活性成分-靶點網絡圖 將辛夷、蟬蛻的18 個共有有效活性成分，以及辛夷、蟬蛻、疾病11 個共有靶點導入Cytoscape 3.8.0，得到辛夷-蟬蛻治療AR 活性成分-靶點網絡圖，見圖2。結果顯示，以化合物MOL000313（Galgravin）及化合物MOL012131（異二氫風藤奎醇A）的靶點最多，各有6個；其次為MOL012123 （脫烷醇內酯A）4 個，MOL000105（原兒茶酸）、MOL012112（去甲檳榔堿）、MOL012125（脫烷醇內酯C）、MOL000314（二苯基四氫呋喃衍生物）各有3 個，可得出這7 個化合物可能是辛夷-蟬蛻治療AR 的核心成分。且從該圖中發現在11 個作用靶點中有6 個靶點與2 種以上活性成分相連。

圖2 辛夷-蟬蛻治療AR 成分-靶點網絡圖

2.6 PPI 網絡與核心靶點分析 通過STRING 數據庫，對已獲得的共有靶點進行PPI 互作網絡圖的繪制，結果發現辛夷-蟬蛻治療AR 的靶點基因有11個。此時，將Degree 值設置為大于6，此時得出的靶點被認為是核心靶點，包括CHRM5、ALOX5、ADRB2、PTGS1、NOS2、PTGS2、CHRM3、CHRM2、KCNH2、ADRA2C 等10 個靶點基因，據此推測這些可能是辛夷-蟬蛻治療AR 的核心靶點基因。見圖3。

圖3 辛夷-蟬蛻治療AR 的靶基因PPI 互作網絡圖

2.7 生物過程及通路富集結果 將辛夷-蟬蛻藥對與AR 共有的10 個核心靶點基因導入metascape 數據庫，并對其進行KEGG 富集分析及3 個GO 富集分析。結果顯示，辛夷-蟬蛻藥對治療AR 主要通過G 蛋白偶聯乙酰膽堿受體信號通路、平滑肌收縮的調節、細胞質核周區、突觸后膜、5-羥色胺受體活性、G 蛋白偶聯5-羥色胺受體活性、突觸后神經遞質受體活性、乙酰膽堿受體活性等生物調節過程，見圖4。對其進行的KEGG 分析結果顯示，辛夷-蟬蛻藥對治療AR主要涉及神經活性配體-受體相互作用信號通路、鈣信號通路等信號通路，見圖5。

圖4 GO 富集分析結果

圖5 KEGG 富集分析結果

3 討論

小兒鼻鼽病因復雜多變，《馮氏錦囊秘錄》中總結鼻鼽病因病機為“更有風邪客于皮毛，是以津液不收……名曰鼻鼽”，外因多為風邪為主的外邪侵襲肺衛，其主要內因為“伏風”留于肺臟，外因作用于內因合而發病，以致肺氣失宣出現鼻塞、流涕、鼻癢、噴嚏頻發、眼癢等癥狀[13]。關聯規則顯示辛夷-蟬蛻藥對是含蟲類藥物組方治療小兒鼻鼽使用支持度最高的藥對。陶弘景《本草經集注》有曰：“辛夷味辛，溫，無毒，主治五臟身體寒風，風頭腦痛”，表明辛夷以其散風寒之功，能夠達到宣通鼻竅的之效。黃元御在《玉楸藥解》中指出了“蟬蛻發表驅風……輕浮發散，專治皮毛”，且蟬蛻歸肺、肝經，具有祛外風、息內風的作用。兩藥配伍使用具有驅風通竅之效，緊扣“外風、伏風”致本病的病因病機，充分體現了中藥處方配伍蟲類藥物治療AR 的用藥特點。

在兒童AR 發病過程中，由各種炎性細胞和細胞因子等構成其發病機制的生物標記物，而這種生物標記物體現了兒童AR 發生的內在特性。因此，藥物成分分子作用機制及其作用靶點的研究可為AR 的精準治療提供參考和依據。

本研究顯示，辛夷-蟬蛻藥對治療AR 的活性成分有化合物MOL000313（Galgravin）、MOL000314（二苯基四氫呋喃衍生物）、MOL012123（脫烷醇內酯A）、MOL012125（脫烷醇內酯C）等木脂素類成分，化合物MOL012131（異二氫風藤奎醇A），MOL000105（原兒茶酸），MOL012112（去甲檳榔堿）等成分。研究發現Galgravin 等木脂素類化合物能有效抑制血小板活化因子（PAF），具有抗炎和鎮痛作用[14-16]，而PAF 是促進血小板活化作用最強的與炎癥和過敏性反應有關的內源性磷脂介質。

運用Cytoscape 3.8.0 軟件篩選出PPI 互作網絡中的10 個核心基因，對它們進行KEGG 富集分析及3 個GO 富集分析。其中，GO 生物富集分析結果表明，辛夷-蟬蛻藥對主要通過影響下列生物調節過程從而改善AR：G 蛋白偶聯乙酰膽堿受體信號通路、血液循環調節的生物過程，細胞質核周區、突觸后膜等細胞組分，5-羥色胺受體活性、G 蛋白偶聯5-羥色胺受體活性、乙酰膽堿受體活性等分子功能。

在AR 的發病過程中，由副交感神經釋放的乙酰膽堿具有刺激腺體分泌黏液，擴張鼻腔血管的作用，導致鼻腔黏液分泌增多，鼻腔變窄通氣受限，進而表現為鼻塞、流涕等癥，經研究證實調節G 蛋白偶聯乙酰膽堿受體信號通路，能控制乙酰膽堿的釋放并獲得脫敏的效果[17]，可有效控制AR。鼻黏膜在炎癥病理狀態下，由于毛細血管內的大量血細胞聚集而導致血流速率降低，從而導致阻力毛細血管收縮或小毛細血管擴張，血管通透性增加，血漿滲出而產生AR 的各種臨床表現[18]，而通過調節血液循環可改善鼻黏膜血管通透性，減少血漿滲出，從而達到改善AR 癥狀的效果。5-羥色胺受體在中樞和外周神經系統參與腺苷酸環化酶信號通路、鉀通道等多種信號通路及調節乙酰膽堿等神經遞質[19]。5-羥色胺受體活性、G 蛋白偶聯5-羥色胺受體活性、乙酰膽堿受體活性的調控，均能通過抑制乙酰膽堿受體（M 受體），參與機體炎癥反應、免疫反應，減少鼻腔黏液分泌、緩解鼻塞、降低氣道高反應性、抗炎，進而緩解過敏性鼻炎癥狀[20]。GO富集結果不僅體現了AR 復雜的發病機制，同時還體現中藥治療AR 具有多靶點的特點和生物特性。

KEGG 分析結果顯示，辛夷-蟬蛻藥對治療AR主要通過神經活性配體-受體相互作用信號通路、鈣離子信號通路等發揮生物學效應。神經活性配體-受體相互作用的信號通路與AR 的發病有密切聯系，此通路是質膜上一切與神經細胞內外信號通路有關的受體、配體的集合[21]，它控制并調節膽堿能功能、生理節律、內分泌等生物功能[22]，使AR 的癥狀得以改善。鈣信號通路參與體內鈣穩態調節，通過調節以內鈣穩態參與體內細胞的增殖、凋亡、轉移的過程，且與血管的生成和平滑肌收縮關系密切[23]，研究顯示鈣離子信號通路與AR 發生的致敏階段中T 細胞的分化關系密切[24-25]。由此推測，辛夷-蟬蛻藥對也能通過調節神經活性配體-受體相互作用信號通路、鈣離子信號通路這兩條信號通路，在AR 的治療中發揮抗炎、抗過敏、維持細胞穩態的作用。

4 結論

本研究通過數據挖掘與網絡藥理學的研究方法，檢索到辛夷-蟬蛻藥對中18 種活性成分及52 個潛在靶點，藥對中過敏性鼻炎有關的靶點有11 個，核心靶點10 個。然后進一步對這些靶點開展了GO 生物過程及KEGG 信號通路富集分析的研究，并由此推測辛夷-蟬蛻藥對治療兒童AR 的物質基礎可能與化合物MOL000313（Galgravin）、MOL000314（二苯基四氫呋 喃 衍 生 物）、MOL012123 （脫 烷 醇 內 酯A）、MOL012125（脫烷醇內酯C）等木脂素類成分及化合物MOL012131（異二氫風藤奎醇A）、MOL000105（原兒茶酸）、MOL012112（去甲檳榔堿）等有關。上述的這些活性成分通過調節CHRM5、ALOX5、ADRB2、PTGS1、NOS2、PTGS2、CHRM3、CHRM2、KCNH2、ADRA2C 等靶點，通過調控G 蛋白偶聯乙酰膽堿受體信號通路、G 蛋白偶聯5-羥色胺受體活性、乙酰膽堿受體活性及5-羥色胺受體活性、鈣離子信號通路、調控神經活性配體-受體相互作用等信號通路，從而抑制炎癥反應、調節免疫功能，進而達到治療過敏性鼻炎的目的，其作用特點表現為多成分、多靶點、多通路。本課題為研究辛夷-蟬蛻在治療兒童AR方面的藥理藥效機制進行了早期的實驗預測，其具體的機理則仍需要通過后續的實驗研究證明。