基于代謝組學探討疏調氣機湯治療甲狀腺功能亢進癥的作用機制

郭 爽，李 蓉，夏宗霄，龍小妹，劉海鵬，范 源，3*

（1. 云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500；2. 云南中醫藥大學第二附屬醫院，云南 昆明 650200；3. 云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明 650021）

甲狀腺功能亢進癥（簡稱甲亢），是由甲狀腺本身或甲狀腺以外器官的多種原因引起的甲狀腺激素增多，可進入血循環中作用于全身的組織和器官，造成機體的神經、循環、消化等系統的興奮性增高，以代謝亢進為主要表現的疾病總稱[1]。中醫理論認為，甲狀腺疾病多與患者情志不暢、肝氣郁結所致的實火內傷存在密切聯系。甲亢屬于中醫“癭病”范疇，常見證型有肝火旺盛、心肝陰虛、氣滯痰阻、痰結血瘀，治療多以疏肝理氣、柔肝化痰、消癭散結等為基本治則。疏調氣機湯為國醫大師張震學術傳承、指導用藥的經典之方，是疏調人體氣機理論中“一體兩翼”之代表方，由柴胡、香附、郁金、丹參、川芎、枳殼、白芍、白術、仙靈脾、茯苓、薄荷、甘草組成，具有疏肝解郁、舒暢氣機、理氣和血之功能，主治肝郁不舒、氣機失調[2]。在臨床治療中，疏調氣機湯被廣泛應用于腫瘤[3-4]、甲狀腺疾病等的治療[5-6]。疏調氣機湯對甲亢有疏肝理氣等治療功效，對其病癥顯示出較好的治療作用[7]。血清代謝組學是研究生物體被擾動后其代謝產物種類、數量及其變化規律的學科，通過揭示內在和外在因素影響下代謝整體的變化軌跡反映發生病理生理過程中的一系列生物事件。代謝組學常被用于藥理實驗中動、植物代謝差異分析，可為臨床應用及食品應用中提供參考依據[8]。在甲亢血清代謝組學的相關研究中，能量代謝、蛋白質氨基酸代謝、糖代謝和脂代謝等相關物質在大鼠體內含量變化明顯[9-11]。本實驗主要根據疏調氣機湯治療甲亢大鼠的血清代謝組學變化及作用機制進行分析及討論。

1 實驗材料

1.1 主要藥物與試劑 優甲樂（Merck KGaA，Darmstadt，德國，貨號：JX20190041），丙基硫氧嘧啶（購自上海朝暉藥業有限公司，貨號：2108N13），甲醇（millipore，美國，貨號：1.00030.4008），乙腈（millipore，美國，貨號：1.06007.4008），氨水（Merck，德國，貨號：105426），乙酸銨（Sigma，美國，貨號：73594），甲酸（millipore，美國，貨號111670），水合氯醛（購自天津市光復精細化工研究所）。中藥材柴胡、香附、郁金、川芎、枳實、白芍、白術、茯苓、山藥，仙靈脾、薄荷、生甘草均購自昆明益生藥業有限責任公司。促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、血清游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）、血清游離甲狀腺素（free thyroxine，FT4）、促甲狀腺素受體抗體（thyrotropin receptor antibody，TRAb）、干擾素γ（interferon-α，IFN-γ）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 23 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質量（200±10）g，購于云南致力科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010，飼養于云南中醫藥大學動物房，大鼠生長環境為室溫24 ℃，濕度60%，自由飲水。動物實驗研究方案已經云南中醫藥大學動物倫理委員會批準（批準號：R-062021G088）。

1.3 實驗儀器 質譜儀（Thermo Scientific，美國，型號：Q Exactive Plus），超高壓液相色譜儀（Shimadzu，中國，型號：Nexera X2 LC-30AD），色譜柱（Waters，美國，型號：ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm × 100 mm column），超聲波系統（Diagenode，美國，型號：Bioruptor），真空離心濃縮機（Eppendorf，德國，型號：Concentrator），離心機（Eppendorf Centrifuge，德國，型號：5430R），可見紫外分光光度計（Thermo，美國，型號：MultiSkan FC）。81-2 恒溫磁力攪拌器（上海酶聯生物科技有限公司），電熱恒溫培養箱（武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動物造模 SD 大鼠適應性喂養1 周后，分為空白組和造模組，造模組進行為期10 d 的皮下注射左甲狀腺素溶液30 μg/100 g，造模后檢測造模組血清中TSH、FT3 和FT4 水平變化，血清指標水平變化符合臨床疾病病理變化，確定造模成功。

2.2 動物分組及給藥 將造模組分為模型組、陽性藥組和疏調氣機湯給藥組。空白組、模型組進行等體積蒸餾水灌胃（100 g/mL），陽性藥組進行丙基硫氧嘧啶水溶液5 mg/（100 g·d）灌胃給藥，給藥組進行疏調氣機湯20.6 g/（kg·d）灌胃給藥，連續給藥6 周，進行取血和組織取材。取材前大鼠禁食12 h，水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心得血清，-80 ℃保存待測。取大鼠甲狀腺進行組織切片及HE 染色，并于顯微鏡下觀察。

2.3 生化指標檢測 大鼠腹主動脈取血，離心，取上清，試劑盒Elisa 檢測FT3、FT4、TSH、TRAB、IFN-γ、TNF-α、IL-6 水平。

2.4 代謝組學檢測 對血清進行代謝物提取，取上清液進行LC-MS/MS 檢測。色譜分析采用SHIMADZU-LC30 超高效液相色譜系統使用ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱進行分離。色譜分離條件：進樣量為3 μL，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min；流動相A：水+25 mM 乙酸銨，B：乙腈。質譜分別采用電噴霧電離（ESI）進行正離子和負離子模式檢測，樣品經UHPLC 分離后，使用QE Plus 質譜儀進行質譜分析，使用HESI 源進行離子化。使用MSDIAL 軟件進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。對得到的數據，刪除組內缺失值＞50%的離子峰，對正負離子數據進行總峰面積歸一化，并整合，使用R 軟件進行模式識別，數據經Unit variance scaling（UV）預處理后，進行后續數據分析。

2.5 統計學分析 所有實驗數據均采用統計學方法處理，采用SPSS 19.0 統計軟件，多組間數據差異顯著性方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血清指標檢測 對大鼠血清進行TSH、FT3、FT4、TRAB 定量檢測，以及驗證因子IFN-γ、TNFα/IL-6。從圖1、表1 可知，與模型組相比，給藥組的TSH 水平顯著升高（P＜0.05），FT3、FT4 與模型組相比，具有下降的趨勢。圖2、表2 顯示，TRAB 與模型組比較，趨勢不明顯。IFN-γ、TNF-α/IL-6 具有顯著的下降趨勢，且疏調氣機湯給藥組與模型組比較存在明顯差異（P＜0.05）。

表1 大鼠血清TSH、FT3、FT4 指標含量濃度（n=5）

圖1 大鼠血清TSH、FT3、FT4 含量變化柱狀圖

圖2 大鼠血清TRAB、IFN-γ、TNF-α/IL-6 含量變化柱狀圖

3.2 甲狀腺組織病理變化 對空白組、模型組、疏調氣機湯給藥組的大鼠甲狀腺進行石蠟切片及HE 染色，見圖3?？瞻捉M可見甲狀腺濾泡腔形態正常，濾泡內胞質分布均勻，濾泡上皮細胞呈扁平狀，未見增生及濾泡間質水腫。模型組可見甲狀腺濾泡上皮細胞腫大，濾泡腔增大，大小形態不一，部分甲狀腺濾泡形態被破壞，濾泡內胞質分布不均，膠質分泌旺盛，甲狀腺濾泡間質水腫，可見部分淋巴細胞聚集，存在炎細胞浸潤。給藥組與模型組比較，甲狀腺濾泡細胞腫大較輕，濾泡內間質部分分布不均，濾泡間質水腫較輕。

圖3 大鼠甲狀腺切片HE 染色圖（100×）

3.3 代謝組學檢測 根據正負離子色譜（圖4）可知，血清中的小分子物質可以在12 min 以前得到很好的分離，且各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊，說明實驗中，儀器引起誤差較小。主成分分析（principal component analysis，PCA）能夠對代謝物進行主成分分析，從總體上反映樣本組間和組內的變異度。偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）運用偏最小二乘回歸建立代謝物表達量與樣品類別之間的關系模型，來實現對樣品類別的預測。其中，R2Y 和Q2 越接近于1，模型越穩定可靠。從圖5中可見，R2Y 均大于0.99，Q2 均大于0.5，即表明模型穩定，且模型的預測能力好（R2、Q2 為回歸直線與Y 軸的截距）。

圖4 大鼠血清正負離子模式圖譜

圖5 代謝組學多元統計分析

甲亢大鼠潛在血清標記物根據VIP 進行篩選，VIP 值越大，物質對分子的貢獻越明顯，并根據P 值進行顯著性篩選。對空白組與模型組大鼠血清代謝物進行比較，有61 種潛在代謝物具有顯著性變化；模型組與疏調氣機湯組大鼠血清代謝物比較，有73 種潛在代謝物具有顯著性變化。以FC＞1.5，logFC≥0 為上調，制作火山圖（圖6）。氣泡圖中可見，空白組與模型組中有16 種潛在標志物下調，10 種潛在標記物上調；模型組與給藥組中有14 中潛在標記物下調，13種潛在標記物上調。

圖6 大鼠體內的血清潛在標記物變化趨勢

對空白組、模型組、疏調氣機湯給藥組進行代謝物Venn 分析（圖7），發現3 組中共同存在的物質有8 種，分別為wedelolactone、solasodine、orotic acid、O-methylarmepavine、N-methylproline、N-fructosyl lsoleucine、levetiracetam 和hesperetin。對物質進行差異代謝物豐度分析，使用t 檢驗檢測相對表達量。模型組（M）與疏調氣機湯給藥組（G）相比，wedelolactone、solasodine、orotic acid、O -methylarmepavine 和N-methylproline 在疏調氣機湯的作用下表達降低，而N-fructosyl lsoleucine、levetiracetam 和hesperetin 表達升高（圖8）。

圖7 大鼠血清代謝物韋恩分析圖

圖8 差異代謝物豐度分析箱型圖

3.4 差異代謝物通路分析 對差異代謝物進行KEGG 通路分析，pathway 從上至下-log10（p-value）依次降低，即p-value 依次升高，顯著性依次降低。如圖9 所示，空白組與模型組比較，所含差異代謝物數量多的通路主要為2-氧代羧酸代謝途徑，神經活性配體-受體相互作用途徑、甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝等，模型組與疏調氣機湯給藥組比較，差異代謝物參與的路徑主要為原發性膽汁酸代謝途徑。

圖9 差異代謝物KEGG 信號通路分析

4 討論

流行病學顯示，甲亢在全球的發病率約為0.2%～1.3%，歐洲平均患病率為0.75%，中國甲亢患病率為1.22%[12]。臨床治療主要以藥物治療、手術治療及放射碘治療為主[13]。甲亢在我國傳統醫學中被列為“癭證”，與肝、脾、心臟存在著聯系[14]。《三因極一病證方論·癭瘤證治》指出，“此乃因喜怒憂思有所郁而成也”，即甲亢的發病多與情志相關。肝屬木，主疏泄，調暢氣機。肝亦為風木之臟，喜條達而惡抑郁，其氣易逆易亢，性剛強。故情志之調節功能，與肝密切相關[15-16]。

國醫大師張震認為，氣之升、降、出、入運動貫穿于整個生命活動，升降運動可促進機體物質代謝，出入運動則可實現機體與外界的物質交換，正由于臟腑不斷升清降濁、吐故納新，機體才能正常新陳代謝，痰、濕、瘀等病理產物方能消散[17]。國醫大師張震結合多年行醫經驗，認識到疏調人體氣機并非單純疏肝理氣解郁所能圓滿實現治療之目的，必須把疏利肝氣與調護脾腎相結合，同時兼顧其他并發癥統籌治之，遂提出“一體兩翼，疏調氣機”理論，即“疏肝為主體，健脾補腎為兩翼”學說[18]。疏調氣機湯具有疏肝解郁、理氣和血等功效，符合辨證論治理論，對甲亢可以起到對癥治療的作用。

實驗結果表明，疏調氣機湯可降低FT3、FT4 水平，升高甲亢大鼠的TSH 水平，對相關炎癥因子水平有較好的抑制作用，并能改善甲狀腺組織的病理形態。代謝組學研究結果顯示，疏調氣機湯對甲亢大鼠體內潛在標記物的含量存在一定影響。根據KEGG通路分析結果，疏調氣機湯在原發性膽汁酸代謝途徑的表達幾率較高。血清代謝物的潛在標記物主要作用：Wedelolactone 存在炎癥疾病中存在調節作用[19-20]；solasodine 能夠抑制癌細胞增殖，促進腫瘤細胞增殖等作用[21]；orotic acid 是由腸道菌群產生的天然產物，是合成嘧啶核苷酸的中間體，能夠影響線粒體產生ATP 的能力，從而影響能量轉化通路，起到保護細胞的作用[22]；O-methylarmepavine 具有較強的抗菌活性[23]；N-methylproline 對疾病代謝存在影響，與疾病的產生存在聯系[24]；levetiracetam 具有抗癲癇等藥理作用[25]；hesperetin 具有抗炎、抗氧化等藥理作用[26]。疏調氣機湯對甲亢大鼠血清標記物影響的相關研究結果提示，疏調氣機湯可能通過調節抗炎、抗氧化、抗菌物質的表達水平，發揮其藥理作用。

綜上所述，本實驗分析疏調氣機湯影響甲亢大鼠血清特異因子及血清潛在標記物的變化，結果表明，疏調氣機湯對甲亢大鼠存在良好的治療作用，并對血清代謝物存在顯著的調節作用，血清代謝標記物表明疏調氣機湯藥理作用可能通過抗炎、抗氧化等代謝途徑發揮治療作用。