去氫木香內酯在內生真菌Y0 液體發酵中的生物轉化研究

郭 晶，陳 帥，鄒秋萍，劉明秀，李寶晶，何紅平，汪偉光，李艷平*

（1. 云南中醫藥大學中藥學院暨云南省南藥可持續利用重點實驗室，云南 昆明 650500；2. 云南中醫藥大學云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室，云南 昆明 650500；3. 云南民族大學國家民委民族藥內生菌天然產物合成生物學重點實驗室，云南 昆明 650500）

微生物轉化（microbial transformation，MT）是通過微生物細胞將復雜的底物進行結構修飾，也就是利用微生物代謝過程中產生的某個或某一系列的酶對底物特定部位進行的催化反應[1]。近年來，微生物轉化技術因具有反應類型廣、特異性強、副產物少、反應條件溫和可控、環保無污染等優點，已逐漸成為開發高活性、低毒性新藥的一條高效途徑[2-3]。利用微生物獨特而多樣的酶系統，以中藥活性成分作為底物，將微生物轉化技術應用于中藥活性成分的結構修飾，可獲得更多結構新穎活性顯著的天然產物，可為現代中藥研發提供一種新的有效路徑。Ma 等[4]報道了Mucor polymorphosporus AS 3.3443 能夠通過有效催化脫氫，使廣木香內酯的C11-C13雙鍵專一性還原轉化為11α，13-二氫脫氫廣木香內酯（11α，13-dihydrodehydrocostuslactone）。劉偉[5]發現Cunninghamella elegans AS 3.2028 能夠轉化莪術二酮為環氧化產物8，9-環氧化莪術二酮。Arakawa 等[6]報道了土曲霉和黑曲霉（Aspergillus terreus）（A. niger）對芽孢素A 的生物轉化，獲得了三種具有新穎結構骨架的倍半萜衍生物。與原始天然產物相比，真菌轉化產物對HL-60細胞的細胞毒性更低。

木香（Aucklandia lappa）具有解痙、降壓及抗菌作用[7]，是多種中成藥的組方之一，例如香砂養胃片，其中主要活性成分是木香烴內酯和去氫木香內酯，其中木香烴內酯0.400～1.463 mg/片，去氫木香烴內酯0.512～0.983 mg/片[8]。木香烴內酯為倍半萜內酯類化合物，結構中α-亞甲基-γ-內酯是其具有抗腫瘤活性的必要基團，天然存在的倍半萜內酯類化合物雖然種類多，但含量較少，相關研究也較少。去氫木香內酯具有愈創木烷骨架[9]，被認為是生物合成倍半萜內酯的重要中間體，但因其較低的水溶性限制了它在臨床上的應用，而通過具有立體和區域專一性的生物轉化作用能夠有效改善其溶解性和生物活性[10]。Choi 等[11]研究了去氫木香內酯的抗腫瘤活性，考察了其對人類乳腺癌細胞和卵巢癌細胞的作用，發現去氫木香內酯具有潛在的抗腫瘤活性。Park 等[12]的研究也表明去氫木香內酯和木香烴內酯還具有顯著抑制人類乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-453 的活性。Liu 等[13-14]主要研究了木香烴內酯對人類肝癌細胞（Hepatic Cell Carcinoma）有絲分裂時細胞活力的影響，表明木香烴內酯可以降低人類肝癌細胞（HCC）有絲分裂時細胞活力，抑制細胞周期。以上研究表明木香中以木香烴內酯和去氫木香內酯為主的衍生物具有較好的生物活性和開發利用前景，而通過生物轉化的方式利用富含豐富酶系的真菌對木香烴內酯和去氫木香內酯進行轉化，有可能獲得毒性較低，生物活性好的結構修飾產物[15]。本研究將探索木香烴內酯和去氫木香內酯在真菌Y0 中生物轉化的情況。同時通過MTT 法檢測轉化產物對結腸癌細胞SW620 的細胞毒性，并根據網絡藥理學預測轉化產物的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；恒溫振蕩培養箱（常州國華電器有限公司）；霉菌培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；分析天平；高效液相色譜儀（安捷倫公司）；AV-600 Hz 核磁共振儀（德國Bruker 公司）。

乙酸乙酯（分析純）、甲醇（色譜純）、葡萄糖（分析純）；木香烴內酯、去氫木香內酯；PDA（Potato Dextrose Agar 馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養基（上海博微生物科技有限公司）；PDB 培養基（新鮮去皮馬鈴薯：葡萄糖：蒸餾水，比例為10 ∶1 ∶50）；正相硅膠柱色譜（100～200 目）。

1.2 菌株培養鑒定和生物轉化 去氫木香內酯和木香烴內酯分別在內生真菌Y0（Coniothyrium pyrinum）發酵液進行生物轉化研究。用PDA 培養基活化菌株Y0，倒置于28 ℃恒溫培養箱中培養，無菌條件下，挑取長勢良好的新鮮菌落放入裝有PDB 培養基離心管，恒溫振蕩培養箱28 ℃、120 rpm 培養。

分別稱取50 mg 去氫木香內酯和木香烴內酯置于離心管中，加DMSO 溶解，用PTFE 膜過濾，制成25 mg/mL 的化合物溶液。取80 μL 化合物溶液至培養液（50 mL）中，混勻并做好標記，設置僅含培養基不含化合物溶液的菌液做為空白對照，恒溫振蕩培養箱28 ℃、120 rpm 培養。第1、3、5、7 天分別取發酵液（2 mL）用等體積乙酸乙酯超聲提取，離心，取上清液旋干，用色譜甲醇溶解后用高效液相檢測，在第3 天有轉化產物生成。

1.3 提取、分離純化及鑒定 培養液加入等體積乙酸乙酯超聲提取30 min，離心，取上清液蒸干，濃縮。將濃縮液用硅膠柱色譜分離，用石油醚-乙酸乙酯（15 ∶1～1 ∶1 梯度洗脫），得到Fr 1～Fr 4，Fr 2 用高效液相色譜檢測。采用色譜柱Zorbax SB-C18（250 mm×9.4 mm，5 μm）；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；以乙腈為流動相A，水為流動相B，乙腈/水=40 ∶60（v/v）；流速：流速3 mL/min 等度洗脫，得到化合物1（5 mg，tR=16.16 min）和化合物2（0.7 mg，tR=15.57 min）。通過薄層色譜GF254 硅膠板，以10%濃硫酸-乙醇顯色檢識轉化產物，根據化合物波譜數據對化合物結構進行解析（1H NMR 和13C NMR）。

1.4 細胞毒檢測方法 收集對數生長期的結腸癌SW620 細胞，以5×104個/mL 的密度接種于96 孔板（100 μL/孔），培養24 h 后去除舊培養基，加入含化合物1、化合物2，且濃度為10～50 μg/mL 的新培養基，并孵育24 h，丟棄上清，每孔加入10 μL 5mg/mL MTT 溶液，4 h 后，去除MTT 溶液，加入200 μL 二甲基亞砜（DMSO）。在波長為490 nm 的酶標儀下測定OD 值。根據以下公式計算細胞存活率：細胞存活率=（A 化合物組-A 調零組）/（A 對照組-A 調零組）×100%。

1.5 化合物1 和2 與結腸癌SW620 細胞靶點預測與分子對接 使用GeneCards（www.genecards.org）數據庫和OMIM（omim.org）數據庫獲取結腸癌SW620細胞相關靶點；使用Swiss Target Prediction（www.swisstargetprediction.ch）數據庫對化合物1 和化合物2 的靶點進行預測；使用Origin 2021 軟件對兩個化合物的靶點與疾病的靶點做交集維恩圖；使用UniProt（www.uniprot.org）數據庫和PDB（www1.rcsb.org）數據庫獲取兩個化合物與疾病各自的交集靶點；使用PyMOL2.3.0 軟件和ChemDraw 2020 軟件對靶點蛋白和兩個化合物分別進行分子對接前處理；使用Auto Dock Tools1.5.6 和Auto Dock Vina1.2.0 軟件對兩個化合物和各自的交集靶點蛋白進行分子對接；使用PyMOL 軟件對對接結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 高效液相色譜檢測圖 去氫木香內酯、木香烴內酯、Y0 菌液以及去氫木香內酯+Y0 菌液和木香烴內酯+Y0 菌液制成檢測液，用乙腈-水（10%～100%）梯度分析30 min，檢測結果如圖1、圖2 所示。

圖1 去氫木香內酯、Y0 菌液、去氫木香內酯+Y0 菌液高效液相檢測圖

圖2 木香烴內酯、Y0 菌液、木香烴內酯+Y0 菌液高效液相檢測圖

2.2 去氫木香內酯在Y0 液體發酵液中轉化過程圖

圖3 去氫木香內酯在Y0 液體發酵液中轉化過程圖

2.3 結構鑒定

2.3.1 化合物1 黃色油狀，C15H20O3，1H-NMR（600 MHz，acetone-d6）δH：2.81（1H，m，H-1），2.11（1H，m，H-2a），2.09（1H，m，H-2b），2.50（1H，m，H-5），3.83（1H，t，J = 9.5 Hz，H-6），1.78 （1H，dd，J = 10.4，9.5 Hz，H-7），2.03（2H，m，H-8），2.50（1H，m，H-9a），1.78（1H，m，H-9b），2.27（1H，m，H-11），1.13（3H，d，J=7.0 Hz，H-13），5.22（1H，m，H-14a），5.21（1H，m，H-14b），4.87（1H，m，H-15a），4.71（1H，m，H-15b）.13CNMR（150 MHz，acetone-d6）δC：44.3（C-1），40.7（C-2），74.5（C-3），156.7（C-4），50.5（C-5），85.8（C-6），50.6（C-7），33.2（C-8），39.0（C-9），151.3（C-10），42.2（C-11），178.5（C-12），13.5（C-13），111.0（C-14），112.0（C-15）. 以上波譜數據與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物1 為（1S，3S，5S，6S，7S，11S）-3- hydroxyl-11，13-dihydrodehydrocostuslactone。

2.3.2 化合物2 無色針晶，C15H20O3，1H-NMR（600 MHz，acetone-d6）δH：2.81（1H，m，H-1），1.92（2H，m，H-2），4.60（1H，m，H-3），2.81（1H，m，H-5），3.96（1H，m，H-6），2.11（1H，m，H-7），1.36（1H，dd，J =12.6，4.6 Hz，H-8a），1.79 （1H，m，H-8b），2.00（1H，dd，J=12.6，4.6 Hz，H-9a），1.92（1H，m，H-9b），2.63（1H，m，H-11），1.10（3H，d，J = 7.8 Hz，H-13），5.24（1H，m，H-14a），5.22（1H，m，H-14b），4.87（1H，s，H-15a），4.73（1H，s，H-15b）.13C-NMR（150 MHz，acetone-d6）δC：44.2（C-1），39.8（C-2），74.4（C-3），156.7（C-4），45.4（C-5），85.8（C-6），51.0（C-7），29.6（C-8），38.8（C-9），151.3（C-10），41.0（C-11），179.7（C-12），11.6（C-13），111.1（C-14），111.9（C-15）. 以上波譜數據與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物2 為（1S，3S，5S，6S，7S，11R）- 3-hydroxyl-11，13-dihydrodehydrocostuslactone.

2.4 化合物1 和2 對結腸癌SW620 細胞的細胞毒性結果顯示，化合物1 和2 對結腸癌SW620 細胞表現出溫和的細胞毒性（表1）。

表1 轉化產物1 和2 對結腸癌細胞SW620 的細胞毒性

2.5 化合物和結腸癌SW620 細胞靶點預測與分子對接結果 使用GeneCards 數據庫和OMIM 數據庫獲取到結腸癌SW620 細胞相關靶點共960 個；使用Swiss Target Prediction 數據庫預測到化合物1 的靶點有100 個，化合物2 的靶點有57 個；化合物與疾病靶點交集圖如下圖4。分子對接結果如下表2、3，一般來說結合能小于-7 kcal/mol 代表結合作用強烈。取各自結合能最好的對接組進行對接情況可視化，如下圖5、6?；衔? 與結腸癌細胞SW620 的交集靶點有26 個，化合物2 與結腸癌細胞SW620 的交集靶點有16 個。其中化合物1 與靶點蛋白VDR 中的LEU-230、LEU-233 和VAL-234 等多個氨基酸殘基形成多條疏水作用鍵，化合物2 與靶點蛋白CDK1 中的ILE-10、VAL-18 和ALA-31 等多個氨基酸殘基形成多條疏水作用鍵，且兩組結合能分別為-9.7 kcal/mol 和-8.5 kcal/mol，結合能優異且結合作用強烈。推斷化合物1 和化合物2 具有抑制結腸癌細胞SW620的作用。

表2 化合物1 與交集靶點結合能數據

表3 化合物2 與交集靶點結合能數據

圖4 化合物1、化合物2 靶點與疾病靶點交集圖

圖5 化合物1 與結腸癌SW620 細胞的蛋白結合圖

圖6 化合物2 與結腸癌SW620 細胞的蛋白結合圖

3 討論

前期研究了木香烴內酯與去氫木香烴內酯在Y0液體菌液中的生物轉化，第1、3、5、7 天分別對菌液檢測，在第3 天檢測有轉化產物生成，但由于木香烴內酯的生物轉化產率低，未能分離得到轉化產物，后期將會繼續優化生物轉化條件，以期分離得到轉化產物。去氫木香內酯在Y0 菌液中轉化得到2 個產物，產物1 轉化產率為10%，產物2 轉化產率為1.4%。作為分子轉化的工具，微生物能夠利用酶對傳統化學合成中的惰性位點進行結構修飾，具有空間選擇性和立體選擇性的特點，能夠實現化學合成難以實現的反應，解決化學合成過程繁瑣、污染、成本過高等問題。羥化酶、還原酶及異構酶是微生物中常見酶[18]，本實驗中通過微生物轉化獲得到的2 個產物1 和2 均是去氫木香內酯C-3 位發生羥基化，C-11 發生還原所得，這表明發生在C-11 的還原反應可能沒有立體選擇的特異性，因此獲得了S、R 兩種構型的產物。

轉化產物1 和2 對結腸癌細胞SW620 具有一定的細胞毒性，通過網絡藥理學對化合物1、2 靶點預測，并從GeneCards 數據庫和OMIM 數據庫獲取結腸癌SW620 細胞相關靶點?；衔? 與結腸癌細胞SW620 的交集靶點有26 個，化合物1 與靶點蛋白維生素D 受體（vitam in D receptor，VDR）結合能為-9.7 kcal/mol，且 與VDR 中 的LEU-230、LEU-233 和VAL-234 等多個氨基酸殘基形成多條疏水作用鍵，結合作用強烈。VDR 是一種核轉錄因子通過與配體特異結合調控多種基因的表達，從而調節多種生命活動的進行，在人體各組織細胞中廣泛存在，在結腸、腎上腺皮質、肺等部位的細胞及淋巴細胞中表達量較高[19-20]。Cross 等[21]研究證實，1，25-二羥基維生素D3能有效降低直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥的死亡率。近年來大量研究表明:1，25-二羥基維生素D3主要通過依賴VDR 途徑調節腫瘤細胞的增殖分化，誘導腫瘤細胞凋亡等，從而抑制腫瘤細胞生長。網絡藥理與分子對接結果顯示化合物1 與VDR 有很好的結合，因此化合物1 有可能通過抑制VDR 發揮潛在治療結腸癌的作用?；衔? 與結腸癌細胞SW620 的交集靶點有16 個，其中與靶點蛋白CDK1 中的ILE-10、VAL-18 和ALA-31 等多個氨基酸殘基形成多條疏水作用鍵，結合能為-8.5 kcal/mol，結合作用強烈。細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent protein kinase 1，CDK1）是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，作為控制細胞周期的起始、進展和終止的主要角色，于細胞周期多個環節中均可作為抗癌天然靶標。由于CDK1 在有絲分裂過程的調控中具有重要作用，已有較多的關于降低CDK1 活性的物質被開發為抗癌藥物。其中，一些藥物可以通過抑制CDK1 的活性阻滯G2/M 期以達到治療結直腸癌的目的。例如斑蝥素就是通過抑制CDK1 活性導致結直腸癌colo 205 細胞中的G2/M 期阻滯和細胞凋亡的[22]。但化合物1、2 抗結腸癌的活性與可能的作用機制有待進一步的體內外實驗來探討。