某品牌抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒的性能評價

尚曉楠（通信作者），尤瑞國，李忠信，謝茜

鄭州安圖生物工程股份有限公司 （河南鄭州 450016）

原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種慢性自身免疫性肝內膽汁淤積性疾病?；颊吲R床癥狀主要為乏力和皮膚瘙癢，隨著病程的發展會出現消化道出血、肝性腦病、膽汁淤積及肝硬化。PBC 的診斷需要綜合影像學、組織學、生物化學及免疫學檢查結果。中華醫學會肝病學分會發布的《原發性膽汁性膽管炎的診斷和治療指南（2021）》中明確了PBC 的診斷標準：（1）存在膽汁淤積的生物化學證據[主要為堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和γ-谷氨酰轉移酶（gamma-glutamyltranspeptidase，GGT）升高]，且影像學檢查排除肝外或肝內大膽管梗阻；（2）抗線粒體抗體/抗線粒體抗體-M2（抗線粒體抗體-M2 是診斷PBC 特異性最高的抗線粒體抗體亞型）陽性，或抗gp210 抗體、抗sp100 抗體陽性；（3）存在非化膿性破環性膽管炎和小膽管破壞的組織學證據；（4）滿足以上3 條標準中的2 條即可診斷為PBC[1]。以上診斷指標中，抗sp100 抗體的特異性較高[2]，已被列入《2017 年歐洲肝病學會臨床實踐指南》[3]，尤其適用于抗線粒體抗體陰性的PBC患者[4-6]。

目前，市場上檢測抗sp100 抗體的方法主要包括間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）（以HEp-2 細胞為基質，熒光模型為典型的“核點型”[7]）、酶聯免疫法、免疫印跡法和化學發光法。IIF 是進行自身抗體初篩的重要手段，但目前我國的IIF 檢測仍以手工操作為主，結果判斷需人工閱片，這會對檢測結果產生較大的主觀影響。酶聯免疫法具有較高的靈敏度和特異性，但自動化程度低、通量小。免疫印跡法同樣具有較高的靈敏度和特異性，但尚無法實現自動化，且其檢測通量、檢測效率均無法滿足當前臨床需求，尤其是條帶判斷中還可能引入主觀偏倚，影響檢測結果的準確性。鄭州安圖生物工程股份有限公司研發生產的抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒采用化學發光法進行檢測，可配合全自動磁微粒化學發光免疫分析儀使用，不僅具有較高的靈敏度和特異性，且具有檢測方法穩定快速、檢測范圍寬、操作簡單且自動化程度高等優點。本研究參照美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的EP 文件，對該試劑盒進行性能評價，以期為PBC 的輔助診斷提供可靠指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標本

收集2022 年1—6 月某醫院收治的132 例PBC患者的血清標本，以及同期的185 名健康體檢者的血清標本。以上標本均采用鄭州安圖生物工程股份有限公司的抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒檢測抗sp100 抗體IgG 濃度，重復檢測3 次，計算平均值作為標定濃度。其中32 份PBC 患者的血清標本和35 份健康體檢者的血清標本用于性能評價，100 份PBC 患者的血清標本和150 份健康體檢者的血清標本用于臨床比對。

1.1.2 儀器和試劑

鄭州安圖生物工程股份有限公司的抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒（檢測方法為化學發光法）。參比試劑盒包括依諾瓦診斷公司的抗sp100 抗體檢測試劑盒（檢測方法為酶聯免疫法，可體外定性檢測人血清抗sp100 抗體IgG，陽性判斷值為25 單位）和江蘇浩歐博生物醫藥股份有限公司生產的自身抗體譜5 項檢測試劑盒（檢測方法為化學發光法，型號為6：sp100，可體外定性檢測人血清或血漿抗sp100 抗體IgG，參考區間為0～20 RU/ml）及配套校準品和質控品。檢測所用儀器包括鄭州安圖生物工程股份有限公司的AutoLumo A2000 Plus 全自動化學發光測定儀、AutoPhomo 酶標儀，重慶科斯邁生物科技有限公司的SMART 6500 型全自動化學發光測定儀。

所用試劑包括血紅蛋白（Lee Biosolutions.Inc，產品編號338-10）、三酰甘油（東京化成工業株式會社，產品編號G0087）、膽紅素（Sigma-Aldrich，產品編號B4126-1G）、生 物 素（Thermo Fisher Scientific，貨號A39257）、氯仿（Sigma-Aldrich，產品編號C2432）、二甲基亞砜（Sigma-Aldrich，產品編號D8418）。

1.2 方法

1.2.1 靈敏度

參考EP17-A 文件[8]進行靈敏度檢測。取5 份標定濃度接近0 AU/ml 的血清標本，每份標本每日重復檢測3 次，共檢測4 d，建立空白限（limit of blank，LoB）。取5 份標定濃度為1～4 倍LoB 的血清標本，每份標本每日重復檢測3 次，共檢測4 d，建立檢出限（limit of detection，LoD）和定量限（limit of quantitation，LoQ）。

(1) 松散巖孔隙水：分布于東、西山溝中，主要由第四系沖洪積層組成，厚度1～8 m。普遍具二元結構，上部為粉質粘土，下部為含砂卵礫石層。滲透性良好，富水性弱-中等，與下伏碳酸鹽裂隙溶洞含水層水力聯系密切。主要由大氣降水補給，動態變化大。

1.2.2 精密度

參考EP5-A2 文件[9]進行精密度檢測。取標定濃度分別為11.20、22.17、81.82 AU/ml（低、中、高水平）的血清標本各1 份，進行重復性和中間精密度檢測。重復性檢測：每份標本重復檢測10 次。中間精密度檢測：每份標本每日檢測2 次，每次檢測間隔2 h，且每次均進行復孔檢測，共檢測20 d，共檢測80 次。計算重復性和中間精密度檢測結果的標準差和變異系數（coefficient of variation，CV）。

1.2.3 線性區間

參考EP6-A 文件[10]進行線性區間檢測。取1 份標定濃度為2.21 AU/ml 的低水平血清標本和10 份標定濃度為200.00～260.00 AU/ml 的高水平血清標本，按10.0 ∶0.0、9.8 ∶0.2、9.7 ∶0.3、9.15 ∶0.85、9.0 ∶1.0、7.0 ∶3.0、5.0 ∶5.0、3.5 ∶6.5、2.0 ∶8.0、1.5 ∶8.5、0.0 ∶10.0 的比例配制成10 組具有梯度水平的線性標本（每組11 份）。每份標本重復檢測3 次，比較標定濃度與理論濃度（根據高、低水平血清標本的標定濃度和稀釋比例推算），以相對偏差＜±10%作為標準得出線性區間。

1.2.4 準確度

參考EP9-A2 文件[11]進行準確度檢測。取5 份標定濃度分別為0.39、0.32、1.85、0.36、15.58 AU/ml的低水平血清標本和8份標定濃度為120.00～200.00 AU/ml的高水平血清標本，以9 ∶1 的比例混合得到8 份回收標本。每份標本重復檢測3 次后求均值，并計算回收率。回收率R=［C×（VS+V0）－C0×V0］/（CS×VS）×100% ，式中C為回收標本的濃度，VS為高水平標本的體積，V0為低水平標本的體積，CS為高水平標本的濃度，C0為低水平標本的濃度?；厥章蔙在90%～110% 范圍內說明準確度符合要求。

1.2.5 抗干擾實驗

1.2.6 臨床比對

用抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒（參考區間為0～20 AU/ml）和兩個參比試劑盒分別檢測100 例PBC 患者的血清標本、150 例健康體檢者的血清標本。采用交叉四格表的方法計算待抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒與兩個參比試劑盒的陽性符合率、陰性符合率和總符合率及95%CI，同時對檢測結果進行一致性分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據統計。采用Kappa檢驗分析檢測結果的一致性，Kappa≥0.75 說明一致性較好，0.4 ≤Kappa＜0.75 說明一致性一般，Kappa＜0.4 說明一致性較差。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 靈敏度

抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒的LoB、LoD、LoQ 分別為1.0、2.0、3.0 AU/ml。

2.2 精密度

抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒重復性的CV＜4.00%，中間精密度的CV＜6.00%，見表1。

表1 抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒精密度檢測結果

2.3 線性區間

10 組線性標本的標定濃度與理論濃度的相對偏差均＜10%，可確定抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒的線性區間為10～200 AU/ml。其中1 組標本的檢測結果見表2。

表2 抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒線性區間檢測結果

2.4 準確度

抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒的回收率R在90%～110%之間，準確度符合要求，見表3。

表3 抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒回收率檢測結果

2.5 抗干擾實驗

血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素、生物素濃度分別為3 000 mg /dl、6 000 mg /dl、50 mg /dl、250 ng/ml時，抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒的干擾率在±10%范圍內，見表4。

表4 抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒抗干擾實驗檢測結果

2.6 臨床比對

抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒與兩個參比試劑盒的臨床比對結果見表5 和表6?？箂p100 抗體IgG 檢測試劑盒與依諾瓦診斷公司參比試劑盒的陽性符合率、陰性符合率和總符合率分別為96.00%（95%CI：86.54%～98.90%）、99.00%（95%CI：96.43%～99.73%）和98.40%（95%CI：95.96%～99.38%），Kappa值為0.950（P＜0.001），表明兩者檢測結果的一致性較好；與江蘇浩歐博公司試劑盒的陽性符合率、陰性符合率和總符合率分別為96.15%（95%CI：87.02%～98.94%）、100.00%（95%CI：98.10%～100.00%）和99.20%（95%CI：97.13%～99.78%），Kappa值為0.975（P＜0.001），表明兩者檢測結果的一致性較好。

表5 抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒與抗sp100 抗體檢測試劑盒的檢測結果比較（份）

表6 抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒與自身抗體譜5 項檢測試劑盒的檢測結果比較（份）

3 討論

血清抗sp100 抗體水平對PBC 患者的病情監測和治療方案的制定具有一定的價值，但目前臨床上可用于檢測抗sp100 抗體水平的試劑盒（如市場占有率較高的依諾瓦診斷公司的抗sp100 抗體檢測試劑盒和江蘇浩歐博生物醫藥股份有限公司生產的自身抗體譜5 項檢測試劑盒）均采用定性檢測，無法動態監測抗體水平的變化[13]。因此，急需能夠定量檢測抗sp100 抗體水平的試劑盒。

鄭州安圖生物工程股份有限公司的抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒是基于定量需求進行開發的，建立了相關的定量檢測指標。但由于缺乏參考物質和標準品，目前該試劑盒的量值僅可實現企業內部溯源。本研究對該試劑盒的性能評價結果顯示，其精密度和準確度均可滿足臨床需求，這將保證檢測結果的可靠性。相比定性檢測試劑盒，該試劑盒具有明確的分析靈敏度指標、線性區間，這將有助于指導臨床醫師準確判斷檢測結果。同時，該試劑盒的抗干擾能力較強（血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素、生物素濃度分別為 3000 mg /dl、6000 mg /dl、50 mg /dl、250ng/ml 時，干擾率在±10%范圍內）。

綜上所述，該品牌抗sp100 抗體IgG 檢測試劑盒性能良好，可滿足臨床檢測需要。