山葡萄‘雙優(yōu)’組織培養(yǎng)生根期愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組分析

韋 偉,單守明,徐文娣,李光宗

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021;2.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西商洛 726000)

0 引 言

【研究意義】山葡萄(VitisamurensisRupr)為葡萄科葡萄屬,具有抗寒耐旱等優(yōu)點,被認為是葡萄屬中最抗寒的物種,是葡萄抗寒育種的重要種質(zhì)資源[1,2]。‘雙優(yōu)’為山葡萄品種,東亞種群,原產(chǎn)中國,具有生長旺盛、抗病耐旱和抗寒力強等優(yōu)點,是加工果汁,釀制山葡萄類甜型葡萄酒的優(yōu)良品種之一[3,4]。人工繁殖時其生根極為困難,因此常規(guī)繁殖方式為嫁接[5]。嫁接繁殖的葡萄苗在鹽堿地易出現(xiàn)缺素、嫁接口愈合不好和嫁接口劈裂等現(xiàn)象,不僅會影響苗木成活率,更會嚴重影響葡萄的產(chǎn)量和質(zhì)量。研究山葡萄生根的分子機理,對其生產(chǎn)中的繁殖具有重要意義。【前人研究進展】常見葡萄生根一般為插條扦插生根和組織培養(yǎng)生根,都離不開生長素類生長調(diào)節(jié)劑,主要為IAA、IBA和NAA,合適的生長素及濃度處理下會顯著提高‘雙優(yōu)’葡萄的生根數(shù)目[5,6]。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠獲得研究對象在特定狀態(tài)下的基因表達情況,進而深入研究其生物學(xué)過程的分子機制[7,8]。【本研究切入點】目前對于山葡萄的組織培養(yǎng)和其生根分子機理的研究并不多。需運用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對‘雙優(yōu)’葡萄組織培養(yǎng)生根期的愈傷組織進行測序和生物信息分析,了解其生根的分子機理,驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果。【擬解決的關(guān)鍵問題】將山葡萄‘雙優(yōu)’組織培養(yǎng)至生根階段,以不同濃度的IBA、NAA和蔗糖誘導(dǎo)生根,對其愈傷組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。篩選差異表達基因,分析COG注釋、GO富集、KEGG富集通路、關(guān)鍵通路表達量等,研究‘雙優(yōu)’葡萄生根的分子機理。

1 材料與方法

1.1 材 料

‘雙優(yōu)’葡萄組織培養(yǎng)所用外植體為寧夏大學(xué)農(nóng)科實訓(xùn)基地內(nèi)獲得的帶芽莖段。材料為2 a生的‘雙優(yōu)’葡萄苗,取樣時間為2021年7月。

1.2 方 法

1.2.1 外植體的消毒

將外植體取回后,選取較為健康的帶芽莖段,立即進行消毒處理。流水充分沖洗10 min后,在超凈工作臺中70%的乙醇溶液消毒45 s,取出后使用無菌水沖洗3次,之后15%的H2O2溶液消毒6 min,再次使用無菌水沖洗4次。

1.2.2 啟動培養(yǎng)

已消毒的帶芽莖段切去兩端約5 mm,末端接入培養(yǎng)基。啟動培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基類型、激素、蔗糖和瓊脂濃度為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂,pH為5.8～6.0。光照時間16 h,光照強度2 500 lx,組培室溫度25 ℃。

1.2.3 生根培養(yǎng)

啟動培養(yǎng)帶芽莖段的芽萌發(fā)長至5 cm左右,在超凈工作臺中切取長勢較為均一的萌發(fā)枝條轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中,每瓶接1個無根苗。設(shè)置IBA(0.1、0.3和0.5 mg/L)、NAA(0.1、0.3和0.5 mg/L)和蔗糖(15、25和35 g/L)處理。培養(yǎng)基類型為1/2B5,瓊脂濃度均為7.5 g/L,光照時間12 h,光照強度2 500 lx,組培室溫度為25℃,每組設(shè)置10個生物學(xué)重復(fù)。觀察其生根狀況,待莖基部愈傷組織生出較小的根系,于根系數(shù)目增長較快時,取下基部愈傷組織切去周圍較小根系,迅速液氮冷凍,并保存于-80℃冰箱中用于轉(zhuǎn)錄組測序及qRT-PCR驗證試驗。表1

表1 正交試驗設(shè)計

1.2.4 RNA提取、文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序

使用植物RNA提取試劑盒(美吉逾華)提取愈傷組織的總RNA,每組3個生物學(xué)重復(fù), 使用Nanodrop 2000(IMPLEN, 美國) 檢測RNA的濃度和純度,使用瓊脂糖凝膠電泳(電壓5 V/cm, 時間15 min)檢測RNA完整性,使用Agilent 2100(Agilent Technologies, 美國)測定RIN值。純化mRNA利用Oligo (dT)磁珠法,并將mRNA打成片段,構(gòu)建cDNA文庫并進行質(zhì)檢。將cDNA的粘性末端補成平末端,利用合成cDNA文庫,由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司基于Illumina Novaseq 6000 測序平臺完成測序。

1.2.5 測序數(shù)據(jù)

對原始測序數(shù)據(jù)(Raw data)進行過濾,得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)(Clean data)。將Clean reads用Hisat2 軟件與參考基因組進行比對,并評估比對結(jié)果。將組裝獲得的基因和轉(zhuǎn)錄本與數(shù)據(jù)庫進行比對,獲得基因和轉(zhuǎn)錄本的功能信息并進行統(tǒng)計。以表達差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1和矯正過的P值(P-adjust<0.05)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)進行基因差異表達分析,篩選不同樣品差異表達基因,分析GO和KEGG富集。

1.2.6 qRT-PCR驗證

從差異表達基因中隨機選取6個進行qRT-PCR驗證。使用RNAprep Pure Plant Plus Kit(TIANGEN)試劑盒提取總RNA;使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKara)試劑盒反轉(zhuǎn)錄;使用UltraSYBR Mixture(CWBIO)試劑盒,運用實時熒光定量PCR儀(Jena, 德國)進行qRT-PCR試驗,選用VvEF基因作為內(nèi)參基因,各反應(yīng)進行3次重復(fù),利用2-△△CT算法計算相對表達量。表2

表2 qRT-PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

研究使用Origin Pro 2021處理數(shù)據(jù)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序樣品的選擇

研究表明,選擇根系數(shù)目差異較大的S1和S6進行轉(zhuǎn)錄組測序,S6明顯生根較多。生根處理20 d后,S6主根數(shù)顯著高于其他組,S1的主根數(shù)目最少。圖1,圖2

圖1 各組‘雙優(yōu)’葡萄組織培養(yǎng)主根數(shù)

圖2 S1和S6‘雙優(yōu)’葡萄生根及組培苗

2.2 總RNA質(zhì)量特征

研究表明,‘雙優(yōu)’葡萄各樣品的OD260/280在2.07～2.15,OD260/230在1.09～2.19,濃度在188.90～454.50 ng/μL,RIN值除S6-1為9.9,其余均為10,各指標(biāo)檢測合格,符合上機要求。樣品總RNA條帶清晰且無彌散、無污染、無降解,品質(zhì)較好,符合上機要求。表3,圖3

注：M. Trans 2KPlus

表3 樣品總RNA 質(zhì)檢

2.3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

研究表明,6組樣品一共獲得Clean reads 284.40 Gb,各樣品Clean reads數(shù)在44.18～49.02 Gb,錯誤率均低于0.03%,Q20均大于98%,Q30均大于94%,各樣品cDNA的鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)核苷酸的GC含量變化范圍在45.95%～46.67%。89.15%～90.3%的Clean Reads 比對到參考基因組上,2.99%～3.67%的Reads比對于多個位置,85.66%～87.02%以上比對于唯一位置。表4

表4 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.4 差異表達基因分析

研究表明, S6較S1顯著上調(diào)的差異表達基因 537個,顯著下調(diào)的差異表達基因277個,共814個差異表達基因, 差異表達基因的差異倍數(shù)大多集中在-5～5,-log10(P-adjust)的0～6,差異表達基因響應(yīng)高濃度生長素和蔗糖主要以上調(diào)表達為主。圖4

圖4 差異表達基因的火山圖

2.5 差異表達基因的COG注釋

研究表明,共805個差異表達基因注釋到COG的21個分類中,其中有450個差異表達基因注釋到未知功能;74個注釋到防御機制;46個注釋到細胞內(nèi)運輸、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運;37個注釋到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。較少注釋到RNA加工與修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)和能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換等條目。圖5

2.6 差異表達基因GO富集

研究表明,分子功能大類中主要包括多糖結(jié)合、微管運動活性和碳水化合物結(jié)合等條目;細胞組分大類中主要包括驅(qū)動蛋白復(fù)合體、胞外區(qū)和微管相關(guān)復(fù)合物等條目;生物學(xué)過程中主要包括基于微管的運動、生長素激活信號通路和蛋白質(zhì)磷酸化等條目。差異基因在生物學(xué)過程富集到的較多,在分子功能和細胞組分中富集到的較少。圖6

圖6 差異表達基因的GO富集

2.7 差異基因KEGG代謝通路

研究表明,共涉及通路84條,差異表達基因在苯丙烷生物合成通路中顯著富集,涉及相關(guān)基因20個,其中8個上調(diào)表達,12個下調(diào)表達;在類黃酮生物合成通路中顯著富集,涉及相關(guān)基因12個,其中6個上調(diào)表達,6個下調(diào)表達;在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中顯著富集,涉及相關(guān)基因16個,其中13個上調(diào)表達,3個下調(diào)表達;在托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成通路中顯著富集,涉及相關(guān)基因7個,其中2個上調(diào)表達,5個下調(diào)表達;在β-丙氨酸代謝通路中顯著富集,涉及相關(guān)基因7個,其中4個上調(diào),3個下調(diào)。此外還有9個差異表達基因在淀粉和蔗糖代謝通路中富集。顯著富集的代謝途徑直接或間接地參與‘雙優(yōu)’葡萄愈傷組織的生根中,其中部分基因可能在生根過程中發(fā)揮重要作用。圖7,圖8

圖7 KEGG富集散點圖

圖8 KEGG富集分析顯著富集通路基因數(shù)

2.8 植物激素相關(guān)基因的表達量

研究表明,H1和H6‘雙優(yōu)’葡萄生根愈傷組織在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中共富集16個。差異基因富集于生長素、細胞分裂素、油菜素內(nèi)酯和水楊酸途徑。生長素途徑包括Aux/IAA和GH3基因家族,轉(zhuǎn)運蛋白LAX3,共11個差異表達基因,在S6中均為上調(diào)表達;細胞分裂素途徑中包含一個A-ARR蛋白相關(guān)基因,S6中為上調(diào)表達;油菜素內(nèi)酯途徑中包括2個TCH4-2相關(guān)基因,在S6中下調(diào)表達,1個CYCD3-1相關(guān)基因,在S6中上調(diào)表達;水楊酸途徑包括1個PR1相關(guān)基因,S6中下調(diào)表達。S6中上調(diào)表達基因較多,尤其生長素途徑,11個差異表達基因均為上調(diào)表達,生長素途徑可能與愈傷組織生根關(guān)系密切。其中有5個上調(diào)表達基因,表達量差異尤為明顯,為IAA14、IAA22、IAA27、LAX3和A-ARR基因,5個基因可能對‘雙優(yōu)’葡萄愈傷組織的生根有重要作用。圖9

注：使用log10(FPKM)值進行聚類分析。紅色代表高表達基因,藍色代表低表達基因,從藍色到紅色為log10(FPKM)逐漸上升

2.9 差異表達基因的qRT-PCR 驗證

研究表明,RNA-seq的表達差異倍數(shù)和qRT-PCR相對表達量進行比較,二者趨勢相近,表明RNA-seq分析結(jié)果可靠。圖10

圖10 部分基因的qRT-PCR 驗證

3 討 論

林茜等[9]得到陽光玫瑰葡萄組織培養(yǎng)的最佳生根激素配比為0.4 mg/L IBA +0.2 mg/L NAA。齊向麗等[10]得到紅國王葡萄組織培養(yǎng)生根階段的適宜蔗糖濃度為25～30 g/L。目前對于山葡萄組織培養(yǎng)的相關(guān)研究并不多,研究中最適處理S6培養(yǎng)基組成為1/2B5+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA+25 g/L蔗糖。愈傷組織轉(zhuǎn)錄組測序分析可知差異基因以上調(diào)表達為主,在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有16個差異表達基因顯著富集,且IAA14、IAA22、IAA27、LAX3和A-ARR基因表達量差異較大,均為上調(diào)表達。

生長素是一種重要的植物激素,在促進不定根的起始和發(fā)生過程中有重要作用,可以在植物的嫩葉、根系和子葉中合成[11-13]。生長素的運輸包括2種形式,韌皮部的長距離運輸和極性運輸[14]。極性運輸離不開其運輸?shù)鞍?包括促進其流入的蛋白(AUX和LAX)和流出蛋白(P-Glycoprotein ABC和PIN)[15],在生長素途徑中富集到LAX3基因,在S6中上調(diào)表達,且于S1中表達量差異較大。生長素是通過一些早期應(yīng)答基因以及轉(zhuǎn)錄因子等來調(diào)控植物的性狀的。生長素早期應(yīng)答響應(yīng)基因主要包括Aux/IAA、GH3和SAUR基因家族[16]。Aux/IAA家族基因是重要的生長素原初響應(yīng)基因,其家族多數(shù)成員都與根系生長發(fā)育有關(guān)[17]。生長素能調(diào)節(jié)Aux/IAA蛋白,之后快速調(diào)控一系列響應(yīng)基因的表達[18]。GH3家族基因是一類功能復(fù)雜的生長素原初響應(yīng)基因,能被植物生長素誘導(dǎo)快速高表達,其功能包括吲哚乙酸(IAA)和茉莉酸(JA)的氨基酸化合成酶功能、在JA和水楊酸(SA) 介導(dǎo)的植物防衛(wèi)反應(yīng)中作用、可以與生長素反應(yīng)因子互作,并參與光反應(yīng)途徑,其中GH3-6屬于Ⅱ類GH3基因,在維持生長素的動態(tài)平衡和調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中作用,可以控制根的生長[19-21]。在生長素途徑中共富集Aux/IAA家族基因7個,GH3家族基因3個,10個基因均在S6中上調(diào)表達。生長素途徑共11個差異表達基因,包括LAX、Aux/IAA和GH3基因家族,均在S6中上調(diào)表達。較高濃度生長素誘導(dǎo)‘雙優(yōu)’葡萄生根,生長素途徑在‘雙優(yōu)’葡萄的生根中發(fā)揮重要作用,其中涉及到IAA14、IAA22、IAA27和LAX3基因表達差異明顯。細胞分裂素途徑中包含2種反應(yīng)調(diào)節(jié)因子,其中A型ARR在細胞分裂素途徑中起負調(diào)控作用[22,23]。ARR-A基因在S6中上調(diào)表達,與S1中表達量差異明顯,調(diào)控細胞分裂素的合成。

4 結(jié) 論

較高濃度的生長素誘導(dǎo)山葡萄‘雙優(yōu)’組織培養(yǎng)生根,植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的生長素途徑在其中作用重要,11個相關(guān)基因全部上調(diào)表達。植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中涉及到表達量差異較大的基因包括IAA14、IAA22、IAA27、LAX3和A-ARR基因,都在S6中上調(diào)表達,5個基因可能在‘雙優(yōu)’葡萄的生根中發(fā)揮重要作用。