血清HCO3-酶法檢測試劑改良路徑的比較研究*

黃 潔,崔 婷,張炳峰,張潔心△

1.蕪湖市中醫醫院檢驗科,安徽蕪湖 241000;2.南京醫科大學第一附屬醫院檢驗學部,江蘇南京 210029

血液中二氧化碳(CO2)主要以碳酸氫鹽(HCO3-)形式存在。由HCO3-和碳酸(H2CO3)組成的緩沖液體系維持機體酸堿平衡和血液pH值。任何導致pH值超出范圍的病理生理狀態都屬于酸堿平衡紊亂[1]。流行病學研究發現,血清HCO3-濃度與高血壓、急性腎損傷進展、惡性腫瘤相關死亡率、心力衰竭有關[2-6]。它還與糖耐量受損、糖尿病相關高風險因子之間存在相關性,并可能成為糖尿病預防相關研究的新靶點[7-8]。因此,及時準確地獲得血清HCO3-濃度對于動態觀察機體酸堿平衡狀態以及疾病鑒別診斷和預后判斷尤為重要。

血清HCO3-濃度可通過血氣分析儀或者生化分析儀進行檢測。為了獲得更加準確的結果,臨床醫生多數選擇留取靜脈血進行生化檢測。磷酸烯醇式丙酮酸羥化酶法(PEPC法)是目前臨床生化實驗室應用最為廣泛的檢測血清HCO3-濃度的方法。循環酶法(CEM法)是近幾年新興的改良酶法。本課題組前期報道了檢測前環境因素可干擾血清CO2濃度檢測[9]。考慮到生化試劑本身性能也會對標本檢測結果產生重要影響,本研究通過比較兩種方法學試劑的開瓶穩定性和試劑組分有效性這兩個方面,進一步評估改良酶法試劑質量,探討未來臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1儀器及試劑 Beckman Coulter公司AU5800 型全自動生化分析儀。CEM法試劑1(貝克曼庫爾特公司,以下稱“C1試劑”)、CEM法試劑2(澳林生物科技有限公司,以下稱“C2試劑”)。PEPC法試劑(邁克生物股份有限公司,以下稱“P試劑”)。CEM法試劑所含供氫體為乙?；?還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(AcNADH),PEPC法試劑所含供氫體為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),其余試劑成分同。C1試劑含AcNADH為1.6 mmol/L,C2試劑含AcNADH為0.5 mmol/L。P試劑含NADH為0.5 mmol/L。反應體系按照試劑盒說明書設置。質控品為美國伯樂公司的生化低值質控品(批號:26461)和高值質控品(批號:26462)。

1.2方法

1.2.1試劑開瓶穩定性 參考美國臨床實驗室標準化協會EP25-A文件[10]結合本實驗室每個月標本量和試劑使用量實際情況制定。C1試劑和P試劑敞口置于生化分析儀內4 ℃保存。每天早上8:30檢測試劑空白,連續檢測20 d,計算各試劑當天空白吸光度值與第一天空白吸光度值的檢測偏倚(BA)。

1.2.2試劑組分有效性 參考美國臨床實驗室標準化協會EP5-A3文件[11]結合本實驗室每個月標本量和試劑使用量實際情況制定。將低值、高值質控品復溶,各分裝20份,置于4 ℃密封保存。每天各取1份,使用C1試劑、C2試劑和P試劑分別進行檢測,連續檢測20 d,計算檢測值的前n天變異系數(CV)。

2 結 果

C1試劑和P試劑開瓶后20 d內空白吸光度值BA均呈現下降趨勢。其中,C1試劑空白吸光度值BA為-1.47%±3.19%,最大變化-11.3%;而P試劑空白吸光度值BA為-19.03%±6.01%,最大可達-28.35%。見圖1。

使用C1試劑、C2試劑和P試劑連續檢測低值、高值質控品20 d。3個試劑的檢測值前n天CV均呈增高趨勢。將最大CV按從大到小排列依次為P試劑(11.43%和13.64%)、C2試劑(6.05%和7.48%)和C1試劑(4.92%和3.72%)。P試劑的低值質控品檢測值前n天CV為6.50%±2.90%,高值質控品檢測值前n天CV為6.34%±3.60%;C2試劑的低值質控品檢測CV為3.71%±1.19%,高值質控品檢測CV為3.47%±2.22%。加大了底物AcNADH濃度的C1試劑,其低值質控品檢測CV為3.62%±1.18%,高值質控品檢測CV為2.35%±1.27%。見圖2。

注:A為檢測低值質控品;B為檢測高值質控品。

3 討 論

NADH是檢測血清HCO3-濃度的生化試劑中的重要供氫體,其在特定波長處有吸收峰。當NADH被中間產物氧化為無吸收峰的NAD+,反應液吸光度值的降低與血清中HCO3-的濃度成正比[12]。由于試劑敞口存放在生化分析儀的試劑托盤上,空氣中的 CO2 也可緩慢與試劑中NADH成分發生非特異性反應,導致試劑空白吸光度值隨著試劑敞口時間延長而發生下降[13-14]。CEM法將NADH修飾成AcNADH,并增加一個獨立的AcNADH循環再生酶促反應體系,即添加葡萄糖組分作為供氫體,在葡糖糖脫氫酶的催化下將氧化型AcNAD再次還原成AcNADH,從而形成閉環。理論上,基于改良方法學的生化試劑能克服環境因素影響,確保開瓶穩定性[15]。本研究數據證實CEM法試劑的開瓶穩定性較PEPC法試劑有顯著提升。

生化酶法檢測血清HCO3-通常采用兩點速率法,即通過測定單位時間內吸光度的降低值來算得血清HCO3-濃度。此法一定程度上能抵消空白吸光度值波動所致的不良影響[16-17]。底物濃度是決定反應速度最重要因素之一。只有當底物濃度足夠大時,酶促反應速度才能保持恒定,使反應處于零級反應期,此時酶促反應速度和酶濃度存在線性關系。隨著反應時間增加,底物濃度快速降低,酶促反應速度逐漸減慢,反應達到非線性期[18]。兩點速率法的吸光度讀點區設定在線性期。若底物濃度不足,零級反應期變短,讀點區在零級反應期之外,檢測線性范圍將變小,檢測精密度變差[19-22]。本研究結果表明,當提高改良酶法試劑中AcNADH濃度至三倍,可更加延長維持試劑成分有效性,全面提高批間精密度。因此,在采用CEM法的基礎上進一步加大底物AcNADH濃度可保證改良酶法試劑質量,提高實驗室檢驗水平,具有廣闊的臨床推廣和應用前景。