沉默lncRNA MALAT1表達對膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響

王壯壯 劉彥廷 龔 偉 周 猛 賈文學 艾文兵 田春雷

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，5 年生存率低于6%，中位生存期僅14.6 個月[1]。由于具有復雜的生物學特性，膠質瘤通常需要采取最大可能保留神經功能為主的切除術輔以術后放化療等綜合治療方案[2]。目前，膠質瘤在免疫治療、腫瘤電場治療和分子靶向治療上研究進展迅速，但這些治療方案并沒有為膠質瘤病人帶來更大的生存獲益，膠質瘤病人的總體預后仍然相對較差[3]。因此如何突破當前膠質瘤特別是膠質母細胞瘤治療的困境是研究者亟待解決的關鍵。近年來的研究發現，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）參與調控多種惡性腫瘤生物學行為[4]。lncRNA轉移性肺腺癌相關基因轉錄本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1）位于細胞核散斑，是一種重要的亞細胞核結構[5]，與核散斑相關蛋白相互作用，通過激活腫瘤細胞內異常信號通路或競爭性抑制微小RNA（miRNA）的表達等多種機制來調控腫瘤細胞的惡性生物學行為[6，7]。本文探討沉默lncRNA MALAT1 表達對膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 生信分析從中國腦膠質瘤基因組計劃數據庫（Chinese glioma atlas，CGGA；http://www.cgga.org.cn/）下載lncRNA MALAT1的臨床數據，使用R軟件分析低級別膠質瘤（low grade glioma，LGG）和高級別膠質瘤（high grade glioma，HGG）中lncRNA MALAT1的表達變化；生存曲線比較低表達和高表達lncRNA MALAT1膠質瘤的總體生存率（overall survival，OS）。

1.2 細胞實驗

1.2.1細胞的來源 人星形膠質細胞（NHA）和膠質瘤細胞系（U87、U251、A172、T98G）購于華中科技大學同濟醫院神經病學研究所，保存于液氮罐和-80 ℃冰箱中。

1.2.2 RT-PCR 檢測膠質瘤細胞lncRNA MALAT1 的表達 使用Trizol 試劑提取總RNA，用Primescript 逆轉錄試劑盒合成cDNA。ABI Prism7500型熒光定量PCR儀進行擴增，每孔加入20 μl反應體系（2 μl cDNA，10 μl 蛋白酶，0.5 μl 上下游產物，7 μl 滅菌雙蒸水），重復進行3 次實驗，每組設置3 個復孔。以GAPDH 為 內 參（上 游 引 物 序 列 5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，下游引物序列5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA- 3'），lncRNA MALAT1 上 游 引 物 序 列 5'- GGACAGGTCAGAGGGTTTC-3'，下游引物序列5'-CTCGTAACTCTTCTCTGTGCC-3'。用2-△△Ct法計算lncRNA MALAT1的相對表達水平。

1.2.3 質粒的構建與細胞轉染 將含lncRNA MALAT1質粒的大腸桿菌菌液接種于含氨芐霉素培養基中，37 ℃培養14～16 h 進行擴增。以3 000 轉/min 離心10 min 后收集菌液。按照質粒提取試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）步驟操作收集質粒，保存于-20 ℃。取對數生長期膠質瘤細胞，接種于6孔板，使用不含抗生素的DMEM 培養24 h。每孔依次加入200 μl Buffer 緩沖液、800 ng 質粒、4 μl 轉染試劑混合液，靜置10 min，均勻轉染各孔24 h 后觀察。sh-MALAT1 組轉染lncRNA MALAT1 質粒，sh-NC轉染空白質粒。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖 將U87 與A172 細胞接種于96孔板，密度為5×103個/孔，輕輕旋轉使細胞均勻分散，37 ℃培養12 h、24 h、48 h、72 h，向每個孔加入CCK8 試劑約10 μl 孵育2 h。使用酶標儀檢測450 nm波長吸光密度值并制作增殖曲線。每組選4個復孔。

1.2.5 免疫印跡法檢測相關蛋白的表達 收集細胞，采用RIPA細胞裂解液充分裂解，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取40 μg 蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓設置為120 V。電泳結束后，120 V轉膜150 min，用5% BSA 封閉PDVF 膜，加入STMN1、RAB5A和ATG4D一抗4 ℃孵育過夜，次日再用PBST緩沖液洗滌3 次，每次5 min，再用GAPDH 標記的二抗孵育2 h，洗滌后滴加EC發光液顯影，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將對數生長期的膠質瘤細胞系U87、A172細胞離心后棄去上清液，依次加入碘化丙碇和異硫氰酸熒光素各6 μl 混勻，避光培養30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3 統計學分析使用R4.0、Graphpad8.0軟件進行分析；計量資料用±s表示，使用t檢驗和方差分析；P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 生信分析結果lncRNAMALAT1 在LGG 和膠質母細胞瘤（Glioblastoma，GBM）中表達量均高于正常組織（P＜0.05；圖1A），且GBM 表達量明顯高于LGG（P＜0.05；圖1A）。lncRNA MALAT1 高表達GBM 病人OS明顯縮短（P＜0.05；圖1B）。

圖1 檢索CGGA數據庫分析膠質瘤lncRNA MALAT1的表達情況

2.2 細胞實驗結果

2.2.1 lncRNA MALAT1在膠質瘤細胞系中的表達情況 與正常腦星形膠質細胞（NHA）相比，U87、A172、U251、T98G 細胞lncRNA MALAT1 相對表達量顯著升高（P＜0.01；圖2），而且，U87 和A172 細胞增高最明顯；因此，使用U87 和A172 細胞系進行后續細胞實驗。

圖2 膠質瘤細胞系lncRNA MALAT1的表達情況

2.2.2 沉默lncRNA MALAT1表達抑制膠質瘤細胞的增殖sh-MALAT1組U87和A172細胞增殖活性均明顯低于sh-NC組（P＜0.05；圖3），而且隨時間延長，細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05；圖3）

圖3 沉默lncRNA MALAT1表達抑制膠質瘤細胞增殖

2.2.3 沉默lncRNA MALAT1表達促進膠質瘤細胞的凋亡sh-MALAT1組U87和A172細胞凋亡率明顯高于sh-NC組（P＜0.01；圖4）。

圖4 沉默lncRNA MALAT1表達促進膠質瘤細胞凋亡

2.2.4 沉默lncRNA MALAT1 表達抑制STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表達TargetScan 軟件分析顯 示STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋 白 為lncRNA MALAT1的下游靶點。CGGA數據庫分析顯示，膠質瘤 組 織lncRNA MALAT1 與STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表達量呈正相關（r分別為0.608、0.833、0.737；P＜0.05）。免疫印跡法檢測U87和A172細胞STMN1、RAB5A和ATG4D的表達結果顯示，sh-MALAT1 組U87 和A172 細 胞STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白表達量明顯高于sh-NC 組（P＜0.05；圖5）。

圖5 沉默lncRNA sh-MALAT1抑制膠質瘤細胞STMN1、RAB5A和ATG4D的蛋白表達

3 討論

lncRNA在腫瘤細胞分化、表觀遺傳和細胞分裂周期調控等多種生命活動中發揮重要作用[8]。lncRNA MALAT1主要在細胞的核散斑中表達，通過調節絲氨酸/精氨酸剪接因子的活性來調控mRNA的選擇性剪接，促進腫瘤的惡性增殖進程[9]。另外，lncRNA MALAT1可通過誘導m6A 甲基化介導miR-1914-3p表達，促進非小細胞肺癌細胞生長[10]。在胃癌細胞中，lncRNA MALAT1 過表達激活PI3K/AKT信號通路，促進癌細胞異常增殖和遷移[11]。還有研究發現，lncRNA MALAT1 與NEAT1 共同作用于PTBP3，導致P53 失活，調控肝癌細胞的增殖與侵襲[12]。

本文結果發現，膠質瘤組織lncRNA MALAT1呈高表達，與病人的不良預后密切相關；細胞實驗發現，沉默lncRNA MALAT1 表達，能夠抑制U87 和A172 細胞增殖，促進凋亡；TargetScan 預測顯示，lncRNA MALAT1 與STMN1、RAB5A、ATG4D 蛋白可能存在結合位點，免疫印跡法檢測結果顯示下調lncRNA MALAT1 抑制STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表達。有研究報道，STMN1、RAB5A 和ATG4D與NF-κB 信號通路的異常激活存在相關性[13]。lncRNA MALAT1可能通過調控NF-κB信號通路，上調STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表達，進而對膠質瘤細胞的增殖和凋亡等生物學行為產生影響。

總之，膠質瘤lncRNA MALAT1 呈高表達，可能通過靶向上調STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表達水平，促進膠質瘤細胞增殖、抑制膠質瘤細胞凋亡。沉默lncRNA MALAT1 表達明顯抑制膠質瘤細胞增殖、促進其凋亡。