Act1 對高糖誘導腎小管上皮細胞炎癥反應及細胞外基質表達的調控作用

趙瑞玲 林彩霞

1 廣州市越秀區兒童醫院 （廣州 510000）

2 廣東藥科大學 （廣州 510000）

糖尿病腎病是常見的糖尿病微血管并發癥之一，也是我國導致終末期腎臟病的常見病因。血糖控制不佳、糖尿病病程長是糖尿病腎病發病的相關因素，腎小球內皮細胞、腎小管上皮細胞在高糖環境下發生損傷是與糖尿病腎病發生發展密切相關的生物學環節［1-2］。有研究報道，腎小管上皮細胞在高糖環境下發生轉分化對糖尿病腎病發病過程中的腎臟纖維化、腎功能損害具有促進作用，轉分化過程涉及炎癥反應激活、細胞外基質沉積［3-4］。核因子-κB激活劑1（NF-κB activator 1，Act1）是近些年新發現的炎癥調控基因，該基因表達的蛋白能夠在胞漿中介導炎癥信號的傳導、促進下游NF-κB活化并激活炎癥反應。為深入認識Act1介導的炎癥反應在糖尿病腎病發生發展中的作用［5］，本研究通過細胞實驗觀察了Act1對高糖誘導腎小管上皮細胞炎癥反應及細胞外基質表達的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

腎小管上皮細胞株MK2購自中科院上海細胞資源中心，陰性對照（negative control，NC）siRNA、Act1 siRNA購自上海吉瑪生物科技公司，總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司，Act1、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、I型膠原（type I collagen，Col-I）、III型膠原（type III collagen，Col-III）的特異性一抗購自美國Abcam公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MK2細胞復蘇后在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中貼壁培養，每2天更換1次培養液，當細胞密度達到約80%時用0.25%胰蛋白酶進行消化，然后收集細胞、按照1∶3比例傳代培養。

1.2.2 細胞分組處理 傳代后的MK2細胞按照1×106個/孔的密度接種在12孔板中，貼壁24 h后進行分組處理。對照組用含有5.5 mmol/L葡萄糖的常規RPMI1640培養基處理，高糖組用含有30 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培養基處理，每組處理12 h、24 h、48 h、72 h；si-NC在常規RPMI1640培養基中轉染NC siRNA，si-NC+高糖組在含有30 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培養基中轉染NC siRNA，si-Act1在含有30 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培養基中轉染Act1 siRNA，每組連續處理48 h。

1.2.3 細胞中基因mRNA表達水平的檢測 取處理后的MK2細胞，使用細胞總RNA提取試劑盒分離提取細胞中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，使用熒光定量檢測試劑盒對cDNA中Act1、E-cadherin、N-cadherin、Col-I、Col-III的mRNA表達進行檢測，按照試劑盒說明書配置PCR反應體系、設置PCR反應程序，以β-Tubulin為內參，計算Act1、E-cadherin、N-cadherin、Col-I、Col-III的mRNA相對表達水平。

1.2.4 細胞中蛋白表達水平的檢測 取處理后的MK2細胞，加入裂解液并在冰上裂解細胞、提取細胞蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，將30 μg蛋白樣本用于檢測，在聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃孵育Act1一抗（1∶400稀釋）、E-cadherin一抗（1∶600稀釋）、N-cadherin一抗（1∶500稀釋）、Col-I一抗（1∶1 000稀釋）、Col-III一抗（1∶1 000稀釋）、β-Tubulin一抗（1∶5 000稀釋）過夜。次日，洗膜3次后室溫孵育辣根過氧化物酶二抗（1∶5 000稀釋）1 h，最后在凝膠成像系統中通過化學發光得到Act1、E-cadherin、N-cadherin、Col-I、Col-III、β-Tubulin的條帶，根據蛋白條帶灰度值，以β-Tubulin為內參計算Act1、E-cadherin、N-cadherin、Col-I、Col-III的蛋白相對表達水平。

1.2.5 細胞培養基中細胞因子含量的檢測 取處理后的MK2細胞培養基，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量。按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0版本的軟件進行統計學處理，實驗數據均為計量資料、以均數±標準差表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 高糖對MK2細胞中Act1表達的影響

處理12 h、24 h、48 h、72 h時，與對照組比較，高糖組MK2細胞中Act1的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平均增加（P＜0.05）；高糖組內不同時間點比較，處理12 h、24 h、48 h時Act1的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平均隨處理時間延長而增加，處理72 h時Act1的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平與處理48 h比較無差異（P＞0.05）。因此后續選擇處理48 h研究Act1的生物學功能。

表1 對照組與高糖組不同時間點MK2細胞中Act1 mRNA相對表達水平的比較 n=5

圖1 對照組與高糖組不同時間點MK2 細胞中Act1 蛋白相對表達水平的比較

圖2 MK2 細胞中Act1 的蛋白條帶圖

圖3 3 組MK2 細胞中E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達水平的比較

圖4 3 組MK2 細胞中E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達水平的比較

2.2 常規葡萄糖和高糖環境下轉染Act1 siRNA對MK2細胞中Act1表達的影響

在常規葡萄糖環境下進行siRNA轉染，處理48 h時，si-NC組與si-Act1組MK2細胞中Act1的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平比較，差異無統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 si-NC組與si-NC+高糖組MK2細胞中Act1 mRNA和蛋白相對表達水平的比較 n=5

在高糖環境下進行siRNA轉染，處理48 h時，與si-NC組比較，si-NC+高糖組MK2細胞中Act1的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平均明顯增加（P＜0.05）；與si-NC+高糖組比較，si-Act1+高糖組MK2細胞中Act1的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平均明顯降低（P＜0.05）。表3。

表3 3組MK2細胞中Act1 mRNA和蛋白相對表達水平的比較 n=5

2.3 敲低Act1對高糖處理MK2細胞中炎癥細胞因子含量的影響

處理48 h時，與si-NC組比較，si-NC+高糖組MK2細胞培養基中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均增加（P＜0.05）；與si-NC+高糖組比較，si-Act1+高糖組MK2細胞培養基中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均降低（P＜0.05）。表4。

表4 3組MK2細胞培養基中TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量的比較 n=5

2.4 敲低Act1對高糖處理MK2細胞中EMT基因表達的影響

處理48 h時，與si-NC組比較，si-NC+高糖組MK2細胞中E-cadherin的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平均降低，N-cadherin的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平均增加（P＜0.05）；與si-NC+高糖組比較，si-Act1+高糖組MK2細胞中E-cadherin的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平均增加，N-cadherin的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平均降低（P＜0.05）。見表5。

表5 3組MK2細胞中E-cadherin、N-cadherin mRNA表達水平的比較 n=5

2.5 敲低Act1對高糖處理MK2細胞中Col-I、Col-III表達的影響

處理48 h時，與si-NC組比較，si-NC+高糖組MK2細胞中Col-I、Col-III的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平均增加（P＜0.05）；與si-NC+高糖組比較，si-Act1+高糖組MK2細胞中Col-I、Col-III的mRNA相對表達水平和蛋白相對表達水平均降低（P＜0.05）。見表6。

3 討 論

腎間質纖維化是糖尿病腎病發生發展過程中重要的病理特征之一，表現為腎小球細胞外基質聚積，最終對腎臟結構和功能造成不可逆損害［6-7］。高糖作用于腎臟、刺激腎小管上皮細胞轉分化與腎間質纖維化的發生密切相關。腎小管上皮細胞轉分化的過程涉及炎癥反應的激活、過度的上皮間質轉化、細胞外基質的過度合成和聚積等生物學環節［8-10］，但調控上述生物學環節的機制尚不十分清楚。

Act1是近些年新發現的炎癥調控基因，編碼產物具有多個炎癥反應調控結構域，在炎癥性腸病、類風濕性關節炎、肺部感染等疾病中通過與多種TRAF蛋白結合的方式促進下游NF-κB活化、啟動多種炎癥基因表達、促進炎癥反應激活［11-12］。為認識Act1在糖尿病腎病發生發展中的作用，本研究首先在高糖處理的腎小管上皮細胞中觀察了Act1表達的變化，高糖處理后各個時間點細胞中Act1的mRNA和蛋白表達均明顯增加，表明Act1高表達可能參與糖尿病腎病的發生以及高糖誘導的腎小管上皮細胞轉分化。

腎小管上皮細胞中Act1在高糖誘導下表達增加的趨勢具有時間依賴性并且Act1表達增加在高糖處理48 h時達到峰值，隨著處理時間延長至72 h、Act1的表達水平未進一步增加。因此，選擇高糖處理48 h的時間點進行Act1生物學功能的研究。為了驗證高糖環境下腎小管上皮細胞中Act1表達增加的生物學意義，本研究通過轉染siRNA手段在高糖環境下敲低Act1的表達，而后觀察腎間質纖維化過程中腎小管轉分化相關的炎癥反應激活、細胞外基質聚集等環節的變化。

高糖作用于腎小管上皮細胞能夠激活炎癥反應、促進細胞外基質合成。炎癥反應激活的過程涉及TNF-α、IL-1β、IFN-γ等多種促炎細胞因子的大量釋放［13-15］；細胞外基質合成的過程中涉及細胞的上皮間質轉化以及膠原的表達增加［16-17］。本研究在高糖處理的腎小管上皮細胞中檢測到TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量以及N-cadherin、Col-I、Col-III表達增加，E-cadherin表達降低，與既往糖尿病腎病發病過程中間質纖維化的研究結果吻合。在高糖環境下敲低Act1后，細胞中TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量以及N-cadherin、Col-I、Col-III表達降低，E-cadherin表達增加，表明Act1參與高糖誘導腎小管上皮細胞炎癥反應激活、細胞外基質表達增加。

綜上所述，高糖促進腎小管上皮細胞中Act1的表達；Act1表達增加對高糖誘導腎小管上皮細胞炎癥反應激活和細胞外基質增多具有促進作用。