TIMELESS、RAB2A、ASPM 在乳腺癌組織中的表達及與臨床特征相關性

劉起鵬 張 婷 郭婉瑩

河南科技大學第一附屬醫院 （洛陽 471000）

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，發病人群多為女性，據數據顯示［1-2］，近年來，隨著人們飲食習慣和生活習慣的改變、工作壓力的增大，乳腺癌的患病率呈逐年上升的趨勢，已對患者生命安全造成嚴重威脅。乳腺癌的發生發展過程中，機體內眾多生長因子、細胞因子及體內激素發生改變，分子生物學技術水平日益提升，再加之分子檢測具有無創性，更易被患者接受，在臨床疾病評估和預后判斷中具有重要作用［3-4］。故從分子水平深入研究乳腺癌潛在的發生、發展機制，在一定程度上有助于輔助疾病診斷、評估疾病治療效果，還對延長患者生存周期具有促進作用［5］。本文研究中對比TIMELESS、鼠肉瘤病毒家族相關蛋白2A（murine sarcoma virus family-related protein 2A，RAB2A）、異常紡錘體樣小頭畸形相關基因（abnormal spindle-like microcephaly，ASPM）在乳腺癌組織、正常乳腺組織中表達及與臨床特征的相關性，旨在尋找診斷乳腺癌的有效分子標志物，為此病的診斷、治療及預后判斷提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019年2月—2021年2月我院乳腺癌組織標本84例作為研究組，年齡25～76歲，正常乳腺組織標本53例作為對照組，年齡28～74歲。2組年齡、BMI、吸煙、飲酒、初發腫瘤、復發腫瘤比較（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究已獲得我院倫理委員會批準。

表1 臨床基線資料比較

納入標準：符合《中國進展期乳腺癌共識指南（CABC 2015）》［6］中乳腺癌診斷標準；所有標本均為根治性手術治療獲得。

排除標準：合并其他系統惡性腫瘤及肝腎功能障礙者；未按醫囑接受治療；病例資料不全；合并血液系統疾病；有中樞神經系統轉移疾病、此前經全身化療或免疫療法治療者。

1.2 指標檢測

1.2.1 主要儀器和試劑 儀器：生物組織包埋冷凍臺購自生物組織包埋冷凍臺（貨號：SPCC-6LA）。試劑：提取總RNA試劑盒購自上海科敏生物科技有限公司（貨號：73404）。

1.2.2 TIMELESS、ASPM檢測 TIMELESS、ASPM采用熒光定量聚合酶檢測，將RNA反轉錄為cDNA，條件：25 ℃、50 ℃、85 ℃（10 min、45 min、5 min）。cDNA進行擴增，引物序列：TIMELESS，F：5′-GGTTCGAGAGATGACTGAGGGCTAT-3′，R：5′-TCCAGGGTAGCTTAGTCC T T T C A A A-3′；引物序列：A S P M，F：5′-T C C G A A G T T G T A A T C G C A G T-3′，R：5′-GTTGCAGGGGATTTGTGATT-3′。以U6為內參，F：5′-GGTTAGAAGTCATACG-3′，R：5′-TGTCATGAATGATCC-3′。反應體系為：10 μL BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix（2×），2 μL cDNA模板，1 μL上下游引物和6 μL H2O。產物擴增條件：95 ℃預變性、變性均5 min，95 ℃退火、72 ℃延伸分別15 s、30 s，共40個循環，TIMELESS、ASPM相對表達量采用2-ΔΔCt計算。

1.2.2 RAB2A檢測 RAB2A采用Western blot檢測RAB2A蛋白表達情況，用RIPA裂解液裂解后進行蛋白抽提，接著進行分離膠濃度為12%的SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，第二天TBST洗膜，孵育二抗，再次洗膜后，加ECL曝光。一抗稀釋度RAB2A（1∶1 000）。

1.3 統計學處理

采用SPSS 26.0處理。用Kolmogorov-Smirnov檢驗數據是否符合正態分布，符合則計量資料使用（±s）進行描述，組間兩兩比較采用獨立t檢驗，多組間行F值數據計算，計數資料以%表示，Pearson相關性分析TIMELESS、RAB2A、ASPM與乳腺癌的相關性，以Logistic回歸模型分析TIMELESS、RAB2A、ASPM與乳腺癌的關系，P＜0.05為具有統計學差異。

2 結 果

2.1 臨床基線資料比較

研究組年齡、BMI、有飲酒史、有吸煙史、初發腫瘤、復發腫瘤與對照組無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 TIMELESS、RAB2A、ASPM在乳腺癌中表達比較

研究組TIMELESS、ASPM比對照組高，RAB2A比對照組低（P＜0.05）。見表2。

表2 TIMELESS、RAB2A、ASPM在乳腺癌中表達比較 （±s）

表2 TIMELESS、RAB2A、ASPM在乳腺癌中表達比較 （±s）

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2.3 TIMELESS、RAB2A、ASPM與乳腺癌臨床特征相關性

TIMELESS、RAB2A、ASPM與乳腺癌患者年齡、腫瘤直徑無關（P＞0.05），TIMELESS、RAB2A、ASPM與乳腺癌淋巴結浸潤、TNM分期、分化程度相關（P＜0.05）。見表3。

表3 TIMELESS、RAB2A、ASPM與乳腺癌臨床特征相關性 （±s）

表3 TIMELESS、RAB2A、ASPM與乳腺癌臨床特征相關性 （±s）

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續表

表3 TIMELESS、RAB2A、ASPM與乳腺癌臨床特征相關性 （±s）

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2.4 乳腺癌影響因素的多元Logistic回歸分析

乳腺癌為因變量（未發生=0，發生=1），TIMELESS、RAB2A、ASPM為自變量，賦值升高設為1，正常設為0，納入二分類多因素Logistic回歸模型分析，結果顯示，TIMELESS、RAB2A、ASPM為影響乳腺癌發生的危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 乳腺癌發生影響因素的多元Logistic回歸分析

2.5 TIMELESS、RAB2A、ASPM之間相關性分析

以TIMELESS、RAB2A、ASPM進行相關性分析，結果顯示，TIMELESS、RAB2A負相關（r=-0.383、P=0.001）；TIMELESS、ASPM正相關（r=0.397、P=0.001）；RAB2A、ASPM負相關（r=-0.257、P=0.018）。見圖1。

2.6 TIMELESS、RAB2A、ASPM在乳腺癌中診斷價值比較

與TIMELESS、RAB2A、ASPM單一檢測相比，TIMELESS、RAB2A、ASPM聯合檢測對乳腺癌的診斷價值較高（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 TIMELESS、RAB2A、ASPM 三項聯合水平診斷乳腺癌ROC 圖

表5 TIMELESS、RAB2A、ASPM在乳腺癌中診斷價值比較

3 討 論

據數據顯示［7-8］，全球乳腺癌的發病例高達約226萬例，已替代肺癌位居全球第一大癌，此病是一種發生于乳腺上皮細胞的惡性腫瘤，具有高度的時間、空間異質性，此病的發病率、死亡率均較高，一方面對女性的生理健康造成威脅，另一方面加重患者及其家屬經濟負擔。因乳腺癌在早期時無典型癥狀和體征，難以引起患者重視，少數患者在確診時已出現遠處轉移的現象，故盡早診斷乳腺癌在一定程度上有助于降低癌癥死亡率。目前臨床上首選治療方案為保守治療，有助于延長患者生命周期；但立足于癌細胞的總負荷而言，手術治療效果更佳，但手術治療存在創傷性［9］。分子標記物由于其非侵入性，更易被廣大患者所接受，故被應用于大多數癌癥的早期診斷和預后評估中。至今，臨床上多用于診斷乳腺癌的分子標記物為多為CEA、CA153、HCY，但靈敏度、特異度均不高，在臨床上僅用于輔助診斷，尋找合適的乳腺癌分子標志物依舊是未來研究的熱點［10-11］。

臨床研究顯示［12-13］，存在于自然界的所有生物對具有周期性的生存環境會做出適應性反應，即生物晝夜節律，晝夜節律是機體內細胞日夜交替自我調節的一種內源性適應機制，在維持生命活動方面具有重要價值；若生物鐘紊亂易增加機體患多種疾病的風險，如在惡性腫瘤中，生物節律異常，則癌細胞呈失控性增長，對疾病的發生發展起促進作用。TIMELESS在肝癌、胃癌、直腸癌、宮頸癌等多種腫瘤中表達具有特異性，如在直腸癌中TIMELESS呈高表達，且其表達與患者腫瘤大小、分化情況、TNM分期、生存情況密切相關，臨床借助于檢測TIMELESS水平變化評估患者病情、預估預后情況［14］。本文結果顯示，TIMELESS在乳腺癌中表達顯著升高，且與乳腺癌淋巴結浸潤、TNM分期、分化程度等臨床特征相關是乳腺癌發生的的危險因素之一，與上述研究結果一致，但在本文研究中并未對TIMELESS具體作用機制進行探究，在后續研究中有待深入挖掘。

RAB2A屬于小GTPase家族的主要成員之一，可調節囊泡轉運、內質網的回收及運動，在口腔鱗狀細胞癌中可介導MAPK信號通路，對口腔鱗狀細胞癌細胞的運動、侵襲起調控作用，進而調節口腔鱗狀細胞癌的發生、發展，有望成為評估疾病進展的分子標志物［15］。黃國定［16］等人研究顯示，RAB2A是RAS蛋白家族的主要成員之一，其在胃癌組織中表達量顯著上升，推測RAB2A是一個潛在的原癌基因，且其表達變化與患者生存周期密切相關，即低表達患者生存情況顯著優于高表達患者，其作用機制可能通過調節Erk信號通路。RAB2A是內質網到高爾基體轉運的必需蛋白，在乳腺癌中對蛋白水解活性具有促進作用，對乳腺癌細胞的3D侵襲性具有調節作用，有望成為乳腺癌患者疾病復發的有力且獨立的預測分子標志物［17］。本文研究結果顯示，RAB2A在乳腺癌組織中呈低表達且乳腺癌淋巴結浸潤、TNM分期、分化程度密切相關，臨床檢測其水平有助于輔助疾病診斷。

有研究顯示［18］，在增殖組織和腫瘤組織中ASPM呈顯著高表達且其水平變化與腫瘤細胞生物學行為、復發和預后相關。臨床研究顯示［19-20］，肝癌、肺腺癌、結腸癌等惡性腫瘤中ASPM表達水平與正常組織存在特異性，如肺腺癌組織中ASPM表達顯著高于肺良性病變肺組織，且其水平變化與患者腫瘤大小、不良預后相關，臨床可通過檢測其水平變化評估肺腺癌的發生發展，采取有效治療措施，改善患者預后。本文數據顯示，乳腺癌組織中ASPM表達顯著高于正常乳腺組織，與上述研究結果一致，且其水平變化與淋巴結浸潤、TNM分期、分化程度相關，臨床可通過檢測ASPM水平變化為乳腺癌治療提供新靶點和理論支撐。

綜上所述，本文結果顯示，乳腺癌組織中TIMELESS、ASPM表達顯著升高，RAB2A表達顯著降低，且其水平變化與年齡、腫瘤直徑無統計學差異，與乳腺癌淋巴結浸潤、TNM分期、分化程度密切相關，早期檢測可作為臨床輔助診斷乳腺癌和評估病情的重要指標，具有重要的臨床參考價值。但本文研究仍存在不足之處，如樣本量小、研究對象單一、病例來源受地域限制，故在今后研究中需增加樣本量、納入多中心研究對象并擴大病例來源范圍，以證實本文研究的準確性。