血清miR-92a-3p、miR-147水平與膿毒癥患者病情嚴重程度、炎癥反應的關系及對預后的評估價值*

張艷敏,王倩倩,楊 珍,劉海麗,王曉艷

邯鄲市中心醫院:1.急診科;2.神經內科,河北邯鄲 056000;3.邯鄲市邯山區疾病預防控制中心,河北邯鄲 056005

膿毒癥是宿主對感染反應失調引起的全身多器官功能障礙性疾病,盡管近年來抗感染治療的醫療技術取得了長足進步,但膿毒癥發病率仍持續上升,病死率一直居高不下[1]。微小核糖核酸(miRNAs)作為一類小型單鏈非編碼調控核糖核酸(RNA),廣泛參與細胞增殖、分化、發育、代謝和凋亡等生物過程,越來越多的證據表明,miRNAs具有免疫和炎癥反應調控作用,其在膿毒癥患者中存在差異性表達,是膿毒癥診斷、治療、預后評估的潛在標志物[2-3]。研究顯示,miR-92a-3p可通過激活核因子-κB(NF-κB)及其下游炎癥通路促進炎癥反應,參與糖尿病患者心血管疾病進展過程[4]。miR-147被證實可通過Toll樣受體-4(TLR4)調節巨噬細胞功能和炎癥,與冠狀動脈粥樣硬化和炎癥性腸病發病有關[5]。然而,miR-92a-3p、miR-147在膿毒癥的報道十分少見,是否與膿毒癥炎癥反應和預后有關尚不清楚,鑒于此,本研究嘗試檢測膿毒癥患者血清miR-92a-3p、miR-147水平,評估其與膿毒癥患者炎癥細胞因子水平及住院期間臨床結局的關系,以期為膿毒癥的臨床診治和預后分析提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年3月至2022年6月邯鄲市中心醫院急診科收治的157例膿毒癥患者納入研究作為患者組,男97例、女60例,年齡41～63歲、平均(52.77±6.03)歲,體重指數19～26 kg/m2、平均(23.41±2.11)kg/m2,膿毒癥病因:感染(97例)、燒傷(23例)、創傷(34例)、其他(3例)。納入標準:(1)存在微生物學證實的感染,序貫器官衰竭(SOFA)評分較基線上升≥2分,而且符合《第三次國際共識:膿毒癥和膿毒性休克新定義》中膿毒癥的診斷標準[6];(2)住院時間>24 h。排除標準:(1)血液腫瘤或實體腫瘤;(2)人類免疫缺陷病毒感染或自身免疫性疾病;(3)妊娠期患者。膿毒癥休克的診斷標準:出現持續性低血壓,充分容量復蘇后仍需血管活性藥來維持平均動脈壓(≥65 mm Hg),血乳酸水平>2 mmol/L[6]。根據是否合并膿毒癥休克將患者分為膿毒癥休克組(66例)和膿毒癥組(91例)。另選擇107例同期邯鄲市中心醫院體檢健康且自愿加入本研究者作為對照組,男59例、女48例,年齡40～65歲、平均(52.95±6.71)歲,體重指數20～26 kg/m2、平均(23.15±2.03)kg/m2。患者組和對照組性別、年齡、體重指數比較差異無統計學意義(P>0.05)。納入研究者或家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究獲得邯鄲市中心醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1miR-92a-3p、miR-147的檢測 受試者入組后當日采集靜脈血3 mL,取血液凝固后上層液體離心5 min(2 000 r/min,離心半徑10 cm)分離得到待測血清標本,于-80 ℃保存。標本檢測時,室溫復融,采用Trizol試劑(美國Ambion公司)提取總RNA,取50 ng總RNA,采用High-Capacity cDNA RT試劑盒(賽默飛世爾科技公司)逆轉錄為cDNA。StepOnePlusTM實時熒光定量PCR系統(賽默飛世爾科技公司)上進行三次重復實時熒光定量PCR(qPCR)檢測。反應體系:DNA模板2 μL,上下游引物各1 μL,SYBR Green Real-time PCR Master Mix(日本Toyobo公司)2 μL,RNase-Free dd H2O 21 μL。反應條件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 2 s,60 ℃ 30 s,40個循環;最后72 ℃延伸10 min。miR-92a-3p、miR-147和U6的引物均由廣州瑞博生物有限公司合成,引物序列如下。miR-92a-3p:正向5′-CGCGTATTGCACTTGTCCC-3′,反向5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;miR-147:正向5′-GTGTGCGGAAATGCTT-3′,反向5′-TCAACTGGTGTCGTGG-3′;U6:正向5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′,反向5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。使用2-ΔΔCt法計算相對表達水平。

1.2.2血清炎癥因子檢測 采用ML-dr3518型酶標分析儀(上海酶聯生物有限公司)檢測受試者入組時的血清白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,采用免疫比濁法檢測C反應蛋白(CRP)水平,檢測試劑盒購自美國Kamiya Biomedical公司。采用羅氏公司Cobas e411型全自動電化學發光分析儀檢測降鈣素原(PCT)水平,試劑盒購自上海紀寧生物科技公司。

1.2.3臨床結局和資料收集 記錄膿毒癥患者院內存活情況,并據此將納入研究的患者分為存活組和死亡組。收集年齡、性別、體重指數、膿毒癥病因、是否合并膿毒癥休克、機械通氣、血管活性藥物應用、并發癥(急性呼吸窘迫綜合征、急性腎損傷、電解質紊亂)、入組時急性生理和慢性健康狀態Ⅱ(APACHE Ⅱ)評分、SOFA評分及清蛋白、尿素氮、血肌酐、乳酸、白細胞計數等資料。APACHE Ⅱ評分的計算參考文獻[7],總分0～71分。SOFA評分根據患者呼吸系統指標、血液系統指標、膽紅素、循環系統指標、神經系統指標、肌酐、尿量最差值計算,總分0～43分[8]。

2 結 果

2.1患者組和對照組血清miR-92a-3p、miR-147水平比較 患者組血清miR-92a-3p水平高于對照組(P<0.05),miR-147水平低于對照組(P<0.05),見表1。

表1 患者組和對照組血清miR-92a-3p、miR-147水平比較

2.2膿毒癥組、膿毒性休克組血清miR-92a-3p、miR-147水平、炎癥因子水平以及SOFA評分、APACHE Ⅱ評分比較 膿毒癥休克組血清miR-92a-3p水平、IL-6、TNF-α、PCT、CRP水平及SOFA評分、APACHE Ⅱ評分均高于膿毒癥組(P<0.05),miR-147水平低于膿毒癥組(P<0.05),見表2。

表2 膿毒癥組、膿毒性休克組血清miR-92a-3p、miR-147、炎癥因子水平以及SOFA評分、APACHE Ⅱ評分比較

2.3膿毒癥患者血清miR-92a-3p、miR-147水平與炎癥因子水平、SOFA評分、APACHE Ⅱ評分的相關性 膿毒癥患者血清miR-92a-3p水平與IL-6、TNF-α、PCT、CRP水平及SOFA評分、APACHE Ⅱ評分均呈正相關(P<0.05),miR-147水平與IL-6、TNF-α、PCT、CRP水平及SOFA評分、APACHE Ⅱ評分均呈負相關(P<0.05),見表3。

表3 膿毒癥患者血清miR-92a-3p、miR-147水平與炎癥因子水平、SOFA評分、APACHE Ⅱ評分的相關性分析

2.4影響膿毒癥患者預后的單因素分析 膿毒癥患者死亡54例,103例存活。死亡組膿毒癥休克、血管活性藥物應用、電解質紊亂、急性腎損傷比例,APACHE Ⅱ評分、SOFA評分,尿素氮、血肌酐、乳酸、血清miR-92a-3p水平及IL-6、TNF-α、PCT、CRP水平均高于存貨組(P<0.05),miR-147水平低于存活組(P<0.05),其他指標比較差異無統計學意義(P>0.05),見表4。

表4 影響膿毒癥患者預后的單因素分析

2.5影響膿毒癥患者預后的多因素分析 以膿毒癥預后(賦值:0=存活,1=死亡)為因變量,以單因素分析中P<0.05的指標為自變量,其中血管活性藥物應用是針對患者病情所采取的措施,尿素氮、血肌酐、乳酸、白細胞計數等指標是臨床公認的因病情所致發生改變的一些指標,經討論決定不作為影響因素進行考察。最終納入膿毒癥休克(賦值:0=否,1=是)、電解質紊亂(賦值:0=否,1=是)、急性腎損傷(賦值:0=否,1=是)和APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、miR-92a-3p、miR-147、IL-6、TNF-α、PCT、CRP等多個指標作為變量進行分析?；貧w采用向后逐步法(α入=0.05,α出=0.10)排除無關變量,最終結果顯示,膿毒癥休克、miR-92a-3p水平升高是膿毒癥患者預后不良的危險因素(P<0.05,OR>1),miR-147水平升高是保護因素(P<0.05,OR<1),見表5。

表5 影響膿毒癥患者預后的Logistic回歸分析結果

2.6血清miR-92a-3p、miR-147水平預測膿毒癥患者預后的價值分析 miR-92a-3p、miR-147預測膿毒癥患者預后不良的曲線下面積(AUC)為0.711、0.723,結合Logistic回歸分析聯合miR-92a-3p、miR-147預測膿毒癥患者預后不良的AUC為0.855,高于單項指標預測,見表6、圖1。

圖1 血清miR-92a-3p、miR-147預測膿毒癥患者預后的ROC曲線

表6 血清miR-92a-3p、miR-147預測膿毒癥患者預后的效能

3 討 論

膿毒癥發病機制復雜,已知炎癥反應失衡、免疫功能障礙、線粒體損傷、凝血障礙、神經內分泌免疫網絡異常、內質網應激、自噬等參與膿毒癥發病以及器官功能障礙過程,其中炎癥反應失衡是膿毒癥發病的關鍵,貫穿膿毒癥發病的全過程,細菌、真菌、寄生蟲、病毒等病原體侵入機體后引起初始的急性反應,導致巨噬細胞激活吞噬病原體并釋放一系列促炎因子,繼而引發細胞因子風暴并激活先天免疫系統,免疫細胞激活后進一步上調炎癥相關基因的表達,加劇炎癥反應,導致多臟器功能障礙[9-10]。miRNAs主要通過促進信使RNA(mRNA)降解或抑制mRNA翻譯來調節基因表達,涉及發育、分化和信號傳導的多種細胞過程,已有證據證明部分miRNAs在免疫細胞活化、炎癥反應調節中發揮重要作用,是炎癥相關介質的重要轉錄調節因子[11-12]。

miR-92a-3p是miR-17-92簇的成員之一,位于C13orf25/MIR17HG基因的第三個內含子內的chr13q31.3上,其在宮頸癌[13]、乳腺癌[14]、胃癌[15]等多種惡性腫瘤中過表達,并對癌細胞增殖、侵襲和對化療敏感性具有調節作用。miR-92a-3p與炎性疾病也存在密切關系,有研究顯示miR-92a-3p可通過早期生長反應蛋白1促使胰腺細胞中胰蛋白酶原的激活,導致急性胰腺炎發病[16],miR-92a-3p還可抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號傳導,增加IL-6和TNF-α的產生,促使肺微血管內皮功能障礙,加重急性肺損傷[17]。本研究發現,與對照組比較,膿毒癥患者血清miR-92a-3p表達上調,且在膿毒癥休克患者中表達更高,進一步分析miR-92a-3p表達與膿毒癥患者APACHE Ⅱ評分、SOFA評分呈正相關,miR-92a-3p表達增高是膿毒癥患者預后不良的危險因素,表明miR-92a-3p與膿毒癥病情以及預后有關,miR-92a-3p可能參與膿毒癥發病和進展過程。分析機制為抑癌基因(PTEN)是PI3K/AKT通路的抑制劑,與NF-κB活化有關,NF-κB活化可激活下游炎癥信號通路參與膿毒癥發病機制,miR-92a-3p通過與PTEN的3′UTR結合激活巨噬細胞中NF-κB信號傳導,上調促炎因子IL-1β和TNF-α的表達,啟動炎癥反應[18],參與膿毒癥發病過程。本研究相關性分析結果顯示,miR-92a-3p與IL-6、TNF-α、PCT、CRP水平呈正相關,表明miR-92a-3p可能參與膿毒癥炎癥反應調節,miR-92a-3p過表達可能促使炎癥因子合成,加劇全身炎癥反應和器官功能衰竭,進而導致不良預后的發生。

miR-147來源于NMES1基因的轉錄本,位于NMES1基因的第4個外顯子,可通過與靶mRNA結合并抑制其靶蛋白的產生,調節細胞增殖、凋亡、遷移、炎癥反應以及病毒復制等各種生物過程,在TLR2、TLR3和TLR4刺激下,miR-147在巨噬細胞中激活,負向調節促炎反應,發揮顯著抗炎特性,以防止過度炎癥反應[5]。研究顯示在分枝桿菌感染過程中,miR-147受ESX-1的負調控,其上調可抑制TLR4/NF-κB通路,繼而抑制IL-6和 IL-10的產生[19],miR-147在急性心肌梗死大鼠模型心肌細胞中表達下調,上調miR-147的表達可通過靶向同源結構域相互作用蛋白激酶2抑制心肌炎癥和細胞凋亡,改善大鼠心功能[20]。本研究結果顯示,膿毒癥患者血清miR-147表達明顯下調,膿毒癥休克患者miR-147表達更低,miR-147低表達與膿毒癥患者預后不良有關,提示miR-147表達下調可能是膿毒癥發病和進展的原因之一。推測可能的原因:膿毒癥炎癥反應急性期,巨噬細胞在病原體相關分子模式和危險相關分子模式下激活,并促使早期炎癥細胞因子的產生[21],miR-147由巨噬細胞中TLRs誘導[5],miR-147表達上調可抑制細胞因子產生從而抑制炎癥反應,當敲除miR-147后炎癥基因表達上調,導致IL-6合成增加,加劇炎癥性器官損傷[22],增加患者預后不良的風險。相關性結果顯示,miR-147與IL-6、TNF-α、PCT、CRP呈負相關,也表明miR-147可能通過負性調控炎癥反應參與膿毒癥發生和進展。

ROC分析結果顯示,miR-92a-3p、miR-147預測膿毒癥患者預后不良的AUC分別為0.711、0.723,miR-92a-3p、miR-147聯合預測膿毒癥患者預后不良的AUC為0.855,較單項預測效能明顯提高,提示聯合檢測miR-92a-3p和miR-147可為膿毒癥患者預后評估提供更可靠信息。回歸分析結果顯示,膿毒癥休克與膿毒癥預后也存在密切關系,這與膿毒癥休克引起和加重全身多臟器功能障礙有關。

綜上所述,膿毒癥患者血清miR-92a-3p表達增高、miR-147表達降低,miR-92a-3p高表達、miR-147低表達與膿毒癥休克、炎癥反應加劇以及預后不良均有關,可作為膿毒癥預后的標志物。miR-92a-3p、miR-147可能通過調控炎癥反應參與膿毒癥發生和進展過程。