外泌體lncRNA-HEIH和let-7a-5p水平在丙型肝炎病毒相關性肝癌患者中的檢測及在預后評估中的價值*

楊建軍,朱建光

咸寧市中心醫院/湖北科技學院附屬第一醫院檢驗科,湖北咸寧 437100

肝癌是發病率較高的惡性腫瘤之一,該疾病具有發病速度快,病死率高等特點,一般患者確診時已至中晚期,預后較差[1]。肝癌是由多因素引起的呈多階段發展的疾病,乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)為主要引發因素,由HCV誘發的丙型肝炎病毒相關性肝癌(C-HCC)呈不斷增多的趨勢[2]。尋找與C-HCC有關的生物標志物對該疾病的診治和預后評估有重要意義。目前,外泌體與肝癌的關系是一個研究的熱點,但具體作用機制尚未明確。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長為200個堿基,但不具備編碼蛋白能力的RNA,可調控細胞的增殖、分化、凋亡等重要生理過程[3]。HEIH是最初發現在HBV中呈高表達的一種lncRNA,深入研究發現,其在多種腫瘤中上調[4]。微小RNA(miRNA)是一類長為20～25個堿基的高度保守小RNA,通過與其靶mRNA特異性結合而調控靶基因的表達[5]。有研究表明,miRNA let-7a-5p在HCV感染導致的肝硬化(HC)患者血清中顯著下調,其水平與慢性丙型肝炎肝纖維化存在密切關系[6]。以往的研究表明,lncRNA-HEIH和let-7a-5p均與HCV有關,但尚未有二者在C-HCC中的共同研究。因此,本研究通過探究外泌體lncRNA-HEIH和let-7a-5p在C-HCC患者中的表達及其在預后評估中的價值,旨在為肝癌患者的有效治療提供可靠的生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2015年1月至2017年1月本院收治的76例C-HCC患者納入研究作為C-HCC組。其中,男43例,女33例;年齡為32～72歲,平均(48.64±7.82)歲;TNM分期:I～Ⅱ期47例,Ⅲ～Ⅳ期29例;35例發生淋巴結轉移,41例未轉移;18例高分化,33例中分化,25例低分化;腫瘤最大徑<5 cm 52例,≥5 cm 24例;腫瘤單發41例,多發35例。納入標準:(1)C-HCC患者符合肝癌診斷標準[7];(2)入院前未接受過抗腫瘤治療;(3)接受肝癌切除手術。排除標準:(1)伴有其他腫瘤;(2)孕婦或產婦;(3)患有其他重大器官疾病;(4)資料缺失者。另選取同期于本院治療的43例由HCV感染導致的HC患者作為HC組。其中,男24例,女19例;年齡31～72歲,平均(48.12±7.63)歲。選取同期于本院治療的52例HCV感染者作為HCV組。其中,男29例,女23例;年齡31～71歲,平均(48.08±7.54)歲。同期于本院體檢的55例健康者作為對照組。其中,男31例,女24例;年齡31～71歲,平均(48.16±7.64)歲。各組性別比例、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)。受試者及家屬均對本研究知情同意,并簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 主要試劑有ExoQuick試劑盒(上海覓拓生物科技有限公司)、Trizol試劑(武漢純度生物科技有限公司)、RNA逆轉錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)、miScript SYBR?Green 實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)。引物由威斯騰生物設計并合成。主要儀器有PCR儀(西安天隆生物科技有限公司)、透射電鏡[研載生物科技(上海)有限公司]。

1.3方法

1.3.1資料收集 收集C-HCC患者的性別、年齡、TNM分期、淋巴結是否轉移、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、腫瘤數目等資料,以及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、甲胎蛋白(AFP)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)水平等臨床生化指標的檢測結果。

1.3.2標本采集 血液標本采集:清晨采集患者5 mL空腹靜脈血,在3 000 r/min條件下離心10 min,保存上清液于-80 ℃備用。外泌體采集:在上一步制備好的標本中加入ExoQuick溶液混勻,1 500 r/min離心30 min,去除上清液,加入PBS緩沖液對沉淀物進行洗滌,銅網上加20 μL懸液并吸干液體,復染后晾干進行外泌體形態觀察,觀察采用透射電鏡。

1.3.3外泌體lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平檢測 在外泌體樣品中加入Trizol試劑進行總RNA提取。將RNA反轉錄為cDNA,按照miScript SYBR?Green qPCR試劑盒說明書行qPCR反應,反應條件如下。95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共45個循環。lncRNA-HEIH、let-7a-5p檢測的內參分別為GAPDH、U6。相對表達水平采用2-ΔΔCt計算。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.3.4隨訪 對C-HCC患者進行5年隨訪,隨訪結束時間為患者死亡或截至2022年1月,隨訪方式包括電話、微信,記錄患者生存情況。

2 結 果

2.1外泌體的形態觀察 透射電鏡下外泌體呈球形,直徑為80～100 nm,符合外泌體直徑要求,可進行下一步研究,見圖1。

圖1 透射電鏡下外泌體的形態

2.2各組外泌體lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平比較 外泌體lncRNA-HEIH水平在對照組、HCV組、HC組、C-HCC組中依次升高,而let-7a-5p水平依次降低,差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組外泌體lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平比較

2.3lncRNA-HEIH與let-7a-5p的關系 生物信息學網站ENCORI顯示,lncRNA-HEIH與let-7a-5p存在結合位點;Pearson相關性分析顯示,lncRNA-HEIH與let-7a-5p水平呈負相關(r=-0.628,P≤0.001)。見圖2、3。

圖2 lncRNA-HEIH與let-7a-5p的結合位點圖

圖3 lncRNA-HEIH與let-7a-5p水平的相關性分析

2.4lncRNA-HEIH、let-7a-5p與C-HCC患者臨床病理特征的關系 分別以lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平的平均值為臨界值,將患者分為高表達組和低表達組。外泌體lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平與C-HCC患者的性別、年齡、腫瘤分化、腫瘤數目、TBIL、ALT無關(P>0.05),與TNM分期、淋巴結是否轉移、腫瘤最大徑、AFP、AST水平有關(P<0.05)。見表3。

表3 lncRNA-HEIH、let-7a-5p與C-HCC患者臨床病理特征的關系(n)

2.5外泌體lncRNA-HEIH、let-7a-5p水平與C-HCC患者預后的關系 對C-HCC患者術后行5年時間的隨訪,lncRNA-HEIH高表達組5年內累積生存率為33.33%(13/39),低于低表達組的70.27%(26/37),差異有統計學意義(P<0.05);let-7a-5p高表達組5年內累積生存率為69.44%(25/36),高于低表達組的35.00%(14/40),差異有統計學意義(P<0.05)。Kaplan-Meier法分析表明,lncRNA-HEIH高表達組5年生存預后差于低表達組,let-7a-5p高表達組5年生存預后好于低表達組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4、5。

圖4 lncRNA-HEIH與C-HCC患者預后的關系

圖5 let-7a-5p與C-HCC患者預后的關系

2.6COX回歸分析影響C-HCC患者預后的因素 單因素COX回歸分析表明,TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤最大徑、AFP、AST、lncRNA-HEIH、let-7a-5p是C-HCC患者預后不良的危險因素;多因素COX回歸分析顯示,TNM分期、AFP、lncRNA-HEIH、let-7a-5p是C-HCC患者預后不良的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 COX回歸分析影響C-HCC預后的危險因素

3 討 論

肝癌是我國臨床中常見的惡性腫瘤之一,具有早期發病不明顯,進展快,預后不佳的特點,HCV侵入肝臟后會誘發肝炎的發生,若沒有得到及時治療會發展為HC,甚至肝癌[8]。在細胞水平上,HCV引起的炎癥反應可能會影響細胞在表觀遺傳學上的變化,從而導致肝癌的發生[9]。目前,切除手術是治療肝癌的有效方式,但其高復發率和高死亡率仍是棘手的問題。因此,尋找C-HCC的生物標志物對預測患者的術后效果有重要作用。

lncRNA是一類具有較差保守性的長鏈非編碼RNA,最初被認為是基因組“噪音”,但隨著研究的深入,發現lncRNA在多種生理、病理過程中發揮重要調控作用[10]。lncRNA-HEIH作為一種功能性RNA,在HC、肝癌中發現明顯上調,已被證實為多種腫瘤的癌基因[11]。有研究表明,外泌體lncRNA-HEIH在肝細胞癌(HCC)中的表達較慢性丙型肝炎(CHC)顯著上調,且外泌體lncRNA-HEIH水平變化對診斷CHC患者肝組織病變有一定的臨床價值[12]。WU等[13]研究表明,lncRNA-HEIH在HCC組織中的表達較癌旁組織顯著上調,體外試驗表明,沉默lncRNA-HEIH可明顯抑制HCC Huh7細胞的增殖和遷移,并促使其凋亡。RUAN等[14]研究發現,lncRNA-HEIH高表達與HBV相關HC和HCC的發生、發展有密切關系。在本研究中,與對照組相比,HCV組、HC組、C-HCC組患者外泌體lncRNA-HEIH水平顯著升高,與HCV組相比,HC組、C-HCC組lncRNA-HEIH水平顯著上升,且C-HCC組顯著高于HC組。進一步研究發現,其水平與腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結是否轉移、AFP、AST水平有關。提示lncRNA-HEIH參與了HCV感染后的疾病發展過程,與肝癌患者的臨床病理特征密切相關。對C-HCC患者術后行5年的隨訪,lncRNA-HEIH高表達組5年累積生存率低于低表達組。提示lncRNA-HEIH在肝癌中作為一種促癌基因會影響患者預后。另外,本研究發現TNM分期、AFP、lncRNA-HEIH是C-HCC預后不良的危險因素。提示臨床中應重點監測上述影響患者預后的危險因素變化,準確判斷患者預后情況,合理制訂治療方案。

miRNA作為一類高保守的小RNA,可調控人類約30%的基因表達,參與細胞的增殖、分化、凋亡等重要生理活動。隨著研究的深入,發現有多種miRNA參與肝癌的發生、發展,有研究在HCV相關的HC和肝癌患者的外泌體和非外泌體中檢測到了miRNA let-7a-5p的水平變化[15]。let-7a-5p在多種腫瘤中下調,LI等[16]研究發現,let-7a-5p在結直腸癌中表達下調,其機制可能為BTB和CNC同源性1(BACH1)通過調節let-7a-5p表達水平,從而促進癌細胞的生長,抑制細胞凋亡。SHI等[17]研究表明,在三陰性乳腺癌患者中let-7a-5p表達下調,高表達患者預后較好,提示let-7a-5p在腫瘤的增殖、轉移和有氧糖酵解中起關鍵作用。LIU等[18]研究發現,高表達的let-7a-5p可抑制人肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲,促進癌細胞的凋亡。結合本研究的結果,let-7a-5p在對照組、HCV組、HC組、C-HCC組中依次降低,且其水平與C-HCC患者的病理特征有緊密關系。提示let-7a-5p參與HCV感染患者病情發展的多個階段。另外,lncRNA-HEIH與let-7a-5p有結合位點,且二者水平呈負相關關系。提示lncRNA-HEIH可能通過調控let-7a-5p水平共同參與C-HCC的發生、發展。對C-HCC患者術后行5年時間的隨訪發現,let-7a-5p高表達組5年累積生存率高于低表達組。提示對let-7a-5p水平實時監控對C-HCC患者的預后評估有重要意義。

綜上所述,外泌體lncRNA-HEIH和let-7a-5p在C-HCC患者中異常表達,其水平與患者臨床病理特征存在密切關系,二者通過某種調控關系共同參與該疾病的發生、發展,及時監測lncRNA-HEIH和let-7a-5p水平的變化對患者預后評估有重要意義。但是本研究在實驗設計時,未納入無HCV感染的肝癌患者作為對照進行分析,且研究的樣本量相對較少,在未來將擴大樣本量,考慮增加無HCV感染的肝癌患者,進一步探討lncRNA-HEIH和let-7a-5p與C-HCC的關系,為C-HCC發生、發展機制的研究提供可靠依據。