宮頸癌患者癌組織中lncRNA HOXA-AS2表達對患者免疫指標水平和不良生存結局的影響*

徐 晶,向圣友,王 燕,江 紅

1.當陽市人民醫院病理科,湖北當陽 444100;2.湖北省婦幼保健院婦產科,湖北武漢 430070;3.湖北文理學院附屬醫院/襄陽市中心醫院婦產科,湖北襄陽 441021

宮頸癌是女性常見的婦科惡性腫瘤之一,是女性惡性腫瘤死亡的第四大原因,2020年的全球新發病例、死亡病例分別為604 127例、341 831例,占女性癌癥相關死亡的7.7%[1]。盡管臨床上宮頸癌手術、放療、化療等治療技術取得較大進展,但患者5年生存率仍相對較低[2]。此外,我國年輕女性宮頸癌患病率仍在持續增加,嚴重威脅女性生命健康[3]。故分析宮頸癌發生、發展的分子機制,對于尋找有效治療靶點,改善預后有重要意義。研究顯示,長鏈非編碼RNA(lncRNA)可以在多個層面對基因表達進行調控,參與細胞生物學活動、免疫反應及耐藥性產生等過程,與宮頸癌發生、發展及預后相關[4]。近期發現,HOXA簇反義RNA 2(HOXA-AS2)在宮頸癌組織中表達上調,發揮促癌作用,沉默HOXA-AS2能夠抑制腫瘤細胞增殖[5]?；诖?本研究分析宮頸癌患者血清與癌組織中HOXA-AS2水平,探究癌組織HOXA-AS2表達與免疫指標、不良生存結局的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年1月至2017年5月在當陽市人民醫院確診的95例宮頸癌患者納入研究作為CC組,宮頸癌患者均符合宮頸癌相關診斷標準[6];根據FIGO分期標準:Ⅰ～Ⅱ期56例(58.95%),Ⅲ～Ⅳ期39例(41.05%);鱗癌52例(54.74%),腺癌33例(34.74%),鱗腺癌10例(10.53%);低分化20例(21.05%),中、高分化75例(78.95%);腫瘤最大徑<3 cm 44例(46.32%),≥3 cm 51例(53.68%)。納入標準:(1)年齡20～65歲,隨訪資料完整;(2)無婦科相關內分泌疾病史;(3)術前結合臨床檢查由兩位副主任醫師以上的病理老師閱片并明確診斷為宮頸癌,術后經病理及免疫組化檢查確診。排除標準:(1)病理診斷不明確者;(2)有損害機體免疫功能的手術史如淋巴結切除術等;(3)術前已經行放療或化療;(4)合并急慢性炎癥;(5)伴其他惡性腫瘤;(6)術前合并血液系統疾病;(7)隨訪時失聯。另外,選取同期因子宮肌瘤行切除子宮的40例患者作為對照組,對照組與CC組一般資料比較見表1。本研究經醫院倫理委員會批準,患者及家屬均簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法

1.2.1標本收集 兩組患者均在入院后次日采集空腹靜脈血,一份離心后獲得上層血清,另一份采用無菌肝素抗凝,貯存在-80 ℃;所有新鮮組織(對照組為宮頸組織,CC組為宮頸癌組織)均由手術或活檢獲取,采用液氮研磨法得到粉末樣品,同樣貯存在-80 ℃備用。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測組織及血清中HOXA-AS2水平 取貯存的組織或血清樣品,采用總RNA抽提試劑盒(貨號:R1200)得到RNA,然后在Aurora-900超微量分光光度計(創譽科技公司)上檢測RNA濃度及質量;取2 μg RNA利用反轉錄試劑盒(貨號:RP1105)得到cDNA;取cDNA按照2×SYBR Green PCR Mastermix(貨號:SR1110)配制反應體系,將混合體系置于ABI 7500熒光定量PCR儀中擴增。設置程序如下:熱啟動95 ℃ 5 min;變性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 30 s,循環40次。試劑盒均由索萊寶公司提供。采用2-ΔΔCt法計算HOXA-AS2的相對表達水平。引物序列設計見表2。

表2 HOXA-AS2及內參基因GAPDH引物序列

1.2.3免疫指標的檢測 使用流式細胞儀(型號:NovoCyte Quanteon,安捷倫)檢測T淋巴細胞亞群(CD3+CD4+CD8+T淋巴細胞)、自然殺傷細胞(CD16+CD56+);采用合肥萊爾生物公司的酶聯免疫吸附試劑盒檢測血清免疫抑制酸性蛋白(IAP)水平(貨號:LE-H1551),按照說明書操作。

1.3隨訪 從宮頸癌患者接受治療第1天開始,于2022年5月截止,以隨訪結束或患者死亡為終點事件。采用門診隨訪、電話方式進行,記錄患者生存狀態、術后恢復情況等。

2 結 果

2.1兩組間組織及血清中HOXA-AS2水平比較 CC組組織及血清標本HOXA-AS2水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);CC組組織與血清HOXA-AS2水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組間組織及血清中HOXA-AS2表達水平比較

2.2兩組免疫指標水平比較 與對照組相比,CC組患者血清IAP水平、CD8+T淋巴細胞百分比、自然殺傷細胞百分比增高,而CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值、CD4+T淋巴細胞百分比降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組血清免疫指標水平比較

2.3宮頸癌患者癌組織中HOXA-AS2表達水平與免疫指標的相關性 癌組織HOXA-AS2表達水平與IAP、CD8+T淋巴細胞百分比、自然殺傷細胞百分比呈正相關(r分別為0.617、0.593、0.528,P分別為0.006、0.015、0.023),與CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值呈負相關(r分別為-0.506、-0.482、-0.539,P分別為0.014、0.028、0.009)。

2.4宮頸癌患者生存預后的影響因素 隨訪12～60個月,中位隨訪時間22個月,共死亡41例。以患者死亡為因變量,將年齡、體重指數、吸煙史、飲酒史、家族史、分化程度、病理類型、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、FIGO分期及HOXA-AS2表達水平作為自變量,納入Cox模型進行單因素分析,并將結果中差異有統計學意義的變量引入Cox回歸模型進行多因素分析,結果發現分化程度為低分化、發生淋巴結轉移、FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期及HOXA-AS2高表達是導致患者死亡(不良生存結局)的危險因素(P<0.05)。見表5～7。

表5 變量賦值

表6 Cox單因素分析

表7 Cox多因素分析

3 討 論

根據癌細胞類型,由宮頸外鱗狀細胞引起的為鱗癌,占宮頸癌的80%,由宮頸內腺細胞引起的為腺癌,占10%～20%[7-8]。中國女性約占全球女性的1/5,加之人口結構、生育模式、年齡結構和生活方式轉變,導致中國女性宮頸癌的發病率、死亡率呈現上升趨勢[9]。手術、放療、化療、抗血管生成藥物、免疫療法等已經應用于臨床,但對于轉移性或晚期宮頸癌治療效果有限,預后仍較差。lncRNA通過多種機制在腫瘤細胞異常增殖、遷移、上皮間充質轉化(EMT)、耐藥及血管生成等過程中發揮關鍵作用[8]。此外,lncRNA能夠調控免疫反應相關基因表達,參與先天和適應性細胞類型(T細胞、CD8+T細胞)的分化和功能調節[10]。因此,探討lncRNA與宮頸癌免疫指標和預后的相關性,有助于為該病的分子機制解析、靶向治療以及化學耐藥性提供新思路。

lncRNA廣泛表達于人體各器官中,不具備編碼蛋白質能力,但能夠通過表觀遺傳等調控靶基因表達,影響細胞信號通路,參與宮頸癌細胞的凋亡、EMT、耐藥性產生等過程,影響宮頸癌預后[11]。HOXA-AS2基因長度為1 048個堿基,位于HOXA簇HOXA3和HOXA4之間的7號染色體,已有研究證實HOXA-AS2在肝癌、膽囊癌、膀胱癌、前列腺癌、口腔鱗狀細胞癌等中表達上調,具有促進腫瘤細胞增殖功能[12]。例如,子宮內膜癌組織中HOXA-AS2表達水平升高,上調的HOXA-AS2通過miR-302C-3P介導的ZFX促進了Ⅰ型子宮內膜癌細胞侵襲、增殖,增加S期細胞比例[13]。有研究報道,HOXA-AS2能夠調控miR-509-3p表達,導致BTN3A1水平增加,促進宮頸癌進展[5]。另有學者發現,HOXA-AS2通過調控Notch途徑在宮頸癌發展中起促癌作用,抑制HOXA-AS2表達則顯著抑制了宮頸癌細胞增殖、遷移[2]。本研究中HOXA-AS2在CC組血清及癌組織中表達水平升高,說明HOXA-AS2在宮頸癌組織及血清中表達趨勢具有一致性,HOXA-AS2與宮頸癌密切相關。但HOXA-AS2在宮頸癌中的異常表達與免疫指標的關系及預后價值尚缺少研究探討。ZHONG等[14]研究發現,HOXA-AS2通過與miR302-a結合,促進KDM2A/JAG1表達,從而促進膠質瘤中Treg細胞增殖,增強免疫耐受性。免疫細胞可以通過影響腫瘤進展而成為免疫治療和臨床結局的影響因素,CD8+T細胞和自然殺傷細胞可以通過CXCL9-11/CXCR3信號通路募集,從而通過一種旁分泌形式抑制腫瘤[15]。本研究CC組血清IAP水平、CD8+T淋巴細胞百分比、自然殺傷細胞百分比增加,而CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值均顯著降低,與任曉紅等[16]研究一致;同時,癌組織HOXA-AS2表達水平與CD8+T淋巴細胞百分比、IAP、自然殺傷細胞百分比呈正相關,與CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值、CD4+T淋巴細胞百分比呈負相關,提示宮頸癌中HOXA-AS2的異常表達能夠抑制CD3+、CD4+T淋巴細胞活化,但會促進CD8+T淋巴細胞活化。

HOXA-AS2的高表達與多種惡性腫瘤如乳腺癌、視網膜母細胞瘤患者的不良預后密切相關。例如,關于急性髓系白血病研究顯示,血漿HOXA-AS2水平在預后危險度分層高危者中表達上調,HOXA-AS2表達水平≥3.54是急性髓系白血病患者預后不良的危險因素[17]。HOXA-AS2在乳腺癌中表達上調,并與淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期和術后生存情況密切相關[18]。平俐等[19]發現,HOXA-AS2高表達患者的3年總生存率低于低表達組,其高表達是視網膜母細胞瘤患兒預后不良的獨立危險因素。為了進一步探討HOXA-AS2在宮頸癌預后判斷中的價值,本研究通過Cox風險模型分析宮頸癌患者不良生存結局的影響因素,發現癌組織HOXA-AS2高表達是不良生存結局的危險因素,因此HOXA-AS2有希望成為宮頸癌患者不良生存結局預測的標志物。

綜上所述,宮頸癌患者血清及癌組織中HOXA-AS2表達水平升高,與患者免疫指標水平存在相關性,而且是影響患者不良生存結局的危險因素。但本研究病例納入來源單一、例數少,HOXA-AS2與宮頸癌患者不良生存結局關系仍需要多中心大樣本來進一步驗證。