Sanger測序和AMRS-PCR檢測ALDH2基因突變結果的比較*

羅 莎,林昌海,毛雪瑩,王貴宇,徐 莉,李 欣,張曉莉△

1.陸軍軍醫大學第一附屬醫院檢驗科,重慶 400038;2.重慶大學附屬腫瘤醫院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫院,重慶400030;3.重慶大學生命科學學院,重慶 401331

硝酸甘油是治療心絞痛急性發作的常規首選藥物,但該藥的臨床療效常因人而異。在中國漢族人群中,含服硝酸甘油無效的比例高達25%以上。有研究證實,使用硝酸甘油效果欠佳的原因與線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)的基因突變有密切關系[1-2]。因此ALDH2基因突變檢測對于預測硝酸甘油的療效有重要作用。目前ALDH2基因突變檢測的方法較多,各有其優缺點。擴增阻滯突變系統(ARMS)又稱等位基因特異性擴增法,是Newton等首先建立用來檢測已知突變的方法。本研究采用ARMS-PCR法以及Sanger測序法分析350例有冠心病、心肌梗死、心絞痛、高血壓等臨床病史患者的ALDH2基因突變情況的檢測結果,通過數據統計分析,比較兩種檢測方法的差異和臨床應用價值,為臨床制訂用藥方案提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將陸軍軍醫大學第一附屬醫院2019年10月至2020年1月收治的有冠心病、心肌梗死、心絞痛、高血壓等病史的患者共350例納入研究。其中34例患者有服藥史;男207例,女143例;患者年齡最小者23歲,最大者93歲,年齡中位數64歲,將≥65歲的患者作為老年組,<65歲的患者作為非老年組。本研究獲醫院醫學倫理學委員會批準,患者對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 使用的儀器包括ABI7300Plus實時熒光定量PCR儀、ABI3730XL測序儀。血液直接PCR試劑盒/膠回收純化試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司提供;測序試劑為BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing。人ALDH2基因多態性檢測試劑盒(ARMS-PCR法)由上海美吉逾華生物醫藥科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1檢測項目 將上海美吉逾華生物醫藥科技有限公司生產的人ALDH2基因多態性檢測試劑盒(ARMS-PCR法)檢測作為評價方法,基因檢測國際金標準——Sanger測序法作為參考方法,對納入研究者的血液標本進行ALDH2基因c.1510多態性位點G>A突變情況檢測。

1.3.1制作血卡 血卡標本:向FTA卡上滴加約30 μL抗凝全血,血液完全滲透FTA卡后,60 ℃烘箱干燥10 min或室溫自然干燥至少4 h。血卡標本采集時不要堆疊血斑,不與其他界面接觸,待血斑充分干燥后應放入無菌袋中,避免標本之間的相互污染。

1.3.2Sanger測序法分析 根據血液直接PCR試劑盒說明書,用血液直接PCR試劑與測序檢測引物構建PCR擴增體系。PCR擴增體系為2×Blood Direct PCR Master Mix 12.5 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,樣品模板1～5片直徑1 mm的血卡,無RNA酶的ddH2O補齊至25 μL。擴增程序為95 ℃預變性5 min,95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共40個循環,最后72 ℃延伸10 min。目標序列PCR擴增結束后,取PCR產物5 μL,用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳,在紫外燈下觀察電泳結果并用天根公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶(530 bp)。測序反應體系為測序染料BigDye 0.5 μL,測序反應液Sequencing Buffer 1.75 μL,引物3.2 pmol,模板10 ng,去離子水補齊至10 μL。擴增程序為96 ℃ 2 min,96 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,60 ℃ 90 s,共25個循環;4 ℃保溫。用醋酸鈉乙醇法進行測序反應產物的純化,向純化好的測序反應產物中加入Hi-Di去離子甲酰胺10 μL,然后95 ℃變性4 min,降溫至4 ℃后拿出,使用測序儀讀取測序數據。用chromas軟件打開測序結果文件,分析所測標本的ALDH2基因c.1510位點的基因型。

1.3.3ARMS-PCR法分析 將所取血卡標本或0.5 μL外周血標本加入0.2 mL的離心管中,加入15 μL的A盒預處理液,充分振蕩混勻并離心,置于95 ℃金屬浴孵育5 min。離心至管蓋和側壁無液體,加入15 μL的A盒穩定液,振蕩混勻并離心,完成待測標本制備。擴增體系為B盒ALDH2 1510G反應液22.5 μL,待測標本2.5 μL以及B盒ALDH2 1510A反應液22.5 μL,待測標本2.5 μL,總共2管。PCR擴增程序為為60 ℃ 50 s,95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,共40個循環,并于第4步時同時收集FAM檢測信號和VIC內參信號。PCR程序運行結束后,導出實驗數據,觀察擴增曲線,分析Ct值。為保證檢測結果的可靠,設置基線為“AutoBaseline”,FAM和VIC通道閾值為0.03。陰性對照管中各信號的Ct值均應>35或為“Undetermined”,否則此次實驗結果無效,重新檢測。陽性質控品檢測反應體系中,FAM和VIC通道均應形成標準擴增曲線,且Ct值均應≤32,否則此次實驗結果無效,重新檢測。對于樣本檢測反應體系,若FAM、VIC通道未形成標準擴增曲線或Ct值>35或“Undetennined”,則該樣本檢測結果為陰性。FAM、VIC通道形成標準擴增曲線,34

1.4統計學處理 根據記錄的檢測結果,釆用MedCalc軟件計算評價方法與參考方法的野生型符合率、雜合突變型符合率、純合突變型符合率以及總符合率。釆用SPSS21.0軟件對兩種方法的檢測結果進行配對χ2檢驗和Kappa檢驗,考察評價方法和參考方法的檢驗結果差異是否有統計學意義,以及評價方法與參考方法的檢測結果是否有較好的一致性;基因型分布的比較采用χ2檢驗;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩種方法檢測結果 350例標本中,Sanger測序法共檢測到ALDH2基因突變116例,其中AA純合突變13例,GA雜合突變103例,總突變型率為33.1%(116/350),GG野生型234例。AA、GA分別占突變型標本的11.2%和88.8%。ARMS-PCR法共檢測到ALDH2基因突變116例,其中AA純合突變13例,GA雜合突變103例,總突變型率為33.1%(116/350),GG野生型234例。AA、GA分別占突變型標本的11.2%和88.8%。

2.2兩種方法的比較 ARMS-PCR法與Sanger測序法的檢測結果比較差異無統計學意義(P>0.05),見表2。Kappa檢驗顯示,ARMS-PCR法與Sanger測序法檢測結果的一致性較好(Kappa≥0.7,P<0.05)。純合突變型陽性符合率為100.00%,95%置信區間為75.30%～100.00%;純合突變型陰性符合率為100.00%,95%置信區間為98.91%～100.00%。雜合突變型陽性符合率100.00%,95%置信區間為96.48%～100.00%;雜合突變型陰性符合率為100.00%,95%置信區間為98.52%～100.00%。野生型陽性符合率為100.00%,95%置信區間為98.44%～100.00%;野生型陰性符合率為100.00%,95%置信區間為96.87%～100.00%。ARMS-PCR法與Sanger測序法對臨床標本的檢測結果一致性較好,具有等效性。

表2 評價方法與參考方法的檢測結果分析(n)

2.2ALDH2基因型與患者性別及年齡的關系 對ARMS-PCR法的檢測結果進行分析。207例男性患者中,共檢出77例突變,總突變率為37.2%,純合突變型11例(5.3%),雜合突變型66例(31.9%)。143例女性患者中,共檢出39例突變,總突變率為27.3%,其中純合突變型2例(1.4%),雜合突變型37例(25.9%)。男性和女性患者ALDH2基因突變率分別37.2%和25.9%,但統計分析顯示ALDH2基因型分布與性別無關(P=0.083),見表3。

表3 ALDH2基因突變與患者性別及年齡的關系

187例<65歲的患者中,共檢出55例突變,總突變率為29.4%,其中純合突變型6例(3.2%),雜合突變49例(26.2%)。163例≥65歲患者中,共檢出61例突變,總突變率為37.4%,其中純合突變型7例(占4.3%),雜合突變型54例(33.1%)。統計分析顯示ALDH2基因型分布與年齡無關(P=0.564)。見表3。

3 討 論

人ALDH2基因位于染色體12q24.2,長44 kb,含有13個外顯子[3]。其編碼的ALDH2同時具有硝酸酯類還原酶和乙醛脫氫酶活性,參與硝酸甘油和乙醇的代謝[4-5]。ALDH2基因的12號外顯子1510位點具有多態性,表現為G突變為A,導致ALDH2編碼的蛋白第487位氨基酸由谷氨酸突變為賴氨酸[6]。目前發現3種基因型,包括野生型GG(編碼產生的ALDH2酶具有正常活性)、雜合突變型AG(編碼的ALDH2只有少量的酶活性)、純合突變型AA(編碼產生的ALDH2幾乎沒有酶活性)[7]。因此,攜帶突變等位基因的個體ALDH2酶活性下降,其代謝硝酸甘油的能力下降,硝酸甘油抗心肌缺血的效應減弱,嚴重影響藥物的作用,導致患者服用硝酸甘油無效的風險大幅增加。在國內,ALDH2基因突變率約為30%～50%,但不同地域、不同民族中的ALDH2等位基因的分布存在一定差異[8-11]。因此患者在使用硝酸甘油前進行ALDH2基因檢測具有重要意義。為保證治療效果,突變基因攜帶者建議慎用硝酸甘油或改用其他藥物。

目前市場上檢測人ALDH2基因多態性的方法有很多,包括測序法、基因芯片法、熒光定量PCR法、高分辨率溶解技術、高效液相色譜法等[12],而Sanger測序法、ARMS-PCR法是應用較多的方法。Sanger測序法是基因突變檢測的金標準,該方法根據雙脫氧測序原理,以峰圖的形式展現基因堿基序列。相較于其他方法,其最大的優點是可直接檢出未知突變,并且檢測結果真實可視,質控環節多,準確率高,假陽性概率低;缺點是檢測成本高,科室須配置昂貴的測序儀,而且對技術要求高,操作步驟復雜、檢測周期時間長,臨床應用有一定的局限性[13]。ARMS-PCR法是利用利用特異性引物對已知的突變靶序列進行高精準PCR擴增,同時應用探針對擴增產物進行檢測,對野生型和突變型基因進行區分。該方法檢測成本較低,設備僅需實時熒光定量PCR儀,實驗步驟操作簡單,檢測周期時間短,而且實驗過程中無需開蓋操作,避免了交叉污染,適用于臨床常規開展。缺點是僅能檢測出已知突變位點,無法檢測未知突變[14]。

本研究比較了ARMS-PCR法與Sanger測序法檢測ALDH2基因突變。研究結果顯示,兩種方法均能準確有效地檢測ALDH2基因突變情況。對ALDH2基因純合突變型、雜合突變型以及野生型的檢測結果總符合率達100.00%,突變型符合率和野生型符合率均為100.00%,說明ARMS-PCR法與Sanger測序法對臨床標本的檢測結果一致性較好,具有等效性。另外本研究發現在350例患者中,ALDH2基因AA純合型突變率為3.7%,GA雜合型突變率為29.4%,總突變率為33.1%,與相關文獻報道中四川、廣州、上海、武漢等地的數據基本一致[15-18]。另外,本研究結果發現ALDH2基因突變與患者性別、年齡均無明顯關聯,與既往的文獻報道一致[8,19-21]。

綜上所述,ARMS-PCR法在ALDH2基因突變檢測中與Sanger測序法高度一致,結果可靠性高,還具有檢測方便、快捷的優點,適用于臨床開展ALDH2基因突變檢測,可為硝酸甘油的臨床用藥選擇提供有參考依據。