低溫脅迫對紫花苜蓿幼苗AsA酶活性的影響

馬亞珺，楊國柱，田海寧

（1.青海大學生態環境工程研究中心，青海西寧 810016；2.青海大學農牧學院，青海西寧 810016；3.青海大學生態環境工程學院，青海西寧 810016）

紫花苜蓿（MedicagosativaL.）是多年生豆科牧草，根系發達，主根粗大，抗寒性、抗旱性和可再生能力較為強大，且產草量高，富含蛋白質，適口性好，固氮能力強，適應性廣，被稱為“牧草之王”[1-2]。在植物體內已發現的抗氧化物中，抗壞血酸含量最為豐富，抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）又名維生素C，常起到抗氧化和輔助7-α-羥化酶促進膽固醇轉化膽汁酸的作用，是植物和大多數生物體內重要的抗氧化劑，在生長發育過程中起著重要作用。在高等植物中，抗壞血酸氧化酶（Ascorbate oxidase，AAO）是一種含銅的酶，位于細胞質中或與細胞壁結合，與其他氧化還原反應相偶聯作為末端氧化酶，能催化抗壞血酸的氧化，具有抗衰老等作用；抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一，又是維生素C 代謝的主要酶類，紫花苜蓿中豐富的維生素C 是飼草中重要活性營養成分[3]；脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）是調控植物體內AsA 氧化還原態的關鍵酶，在循環利用AsA、維持植物體內AsA 的正常代謝水平、保護細胞組分抵御氧化損傷方面發揮著重要作用[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、儀器、試劑

1.1.1 試驗材料

試驗材料為青大1 號、大業1 號、中苜1 號、中蘭2 號、甘農3 號、甘農9 號和WL232 紫花苜蓿幼苗。

1.1.2 試驗儀器

試驗儀器有培養皿、人工氣候箱、分析天平、研缽、50 mL 量筒、50 mL 三角瓶、微量滴定管、滴定架、離心機、恒溫水浴槽、洗耳球、酶標板、EP 管及紫外分光光度計等。

1.1.3 試驗試劑

試驗試劑有碘酸鉀、冰醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、抗壞血酸、淀粉溶液、乙醇、偏磷酸、三氯乙酸、雙蒸水及牛血清蛋白等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料的準備

采用盆栽試驗，選用大小均勻、顆粒飽滿的紫花苜蓿種子，將其用75%的乙醇溶液消毒后，播種在標記好的花盆中，每盆播種50粒，每個品種播種12 盆。將播種好的花盆置于人工氣候室內進行培養，溫度保持在25 ℃。于播種后90 d 進行試驗。

1.2.2 試驗實施

在進行低溫處理時，將人工氣候室溫度調至4 ℃，同時設置脅迫時間，共設置0 h（CK）、24 h（T1）、48 h（T2）、72 h（T3）4 個處理，并分別測定紫花苜蓿AsA 酶活性。

1.2.3 項目測定

采用碘量法測定抗壞血酸氧化酶活性、采用紫外吸收法測定抗壞血酸過氧化物酶活性、采用微量法測定脫氫抗壞血酸還原酶活性。

1.3 數據處理

運用Excel 2010和SPSS 26.0軟件進行繪圖與統計分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗抗壞血酸氧化酶活性的影響

紫花苜蓿幼苗在4 ℃低溫脅迫過程中，AAO 活性變化如圖1 所示。由圖1 可知，隨著處理時間的延長，T2、T3處理紫花苜蓿幼苗體內AAO 活性呈上升趨勢。在T3處理下，青大1 號AAO 活性顯著高于其他品種（p＜0.05）。在T1處理下，各紫花苜蓿幼苗體內AAO 活性表現為WL232＞青大1 號＞大業1 號＞中苜1 號＞中蘭2 號＞甘農9 號＞甘農3 號；在T2處理下，各紫花苜蓿幼苗體內AAO 活性表現為青大1號＞WL232＞甘農9 號＞中苜1 號＞大業1 號＞中蘭2 號＞甘農3 號；在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗體內AAO 活性表現為青大1 號＞甘農9 號＞WL232＞中苜1 號＞大業1 號＞中蘭2 號＞甘農3 號。這表明低溫脅迫可促進紫花苜蓿幼苗體內的AAO 發揮作用，清除植物體內聚集的活性氧，使種植在高寒地區的紫花苜蓿能夠很好地抵御冷害。

2.2 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗抗壞血酸過氧化物酶活性的影響

紫花苜蓿幼苗在4 ℃低溫脅迫過程中，APX 活性變化如圖2 所示。由圖2 可知，7 個品種紫花苜蓿幼苗體內的APX 活性在T1處理下達到高峰，隨后逐漸呈現下降趨勢。在T2處理下，只有甘農3 號幼苗體內APX 活性顯著低于其他紫花苜蓿品種（p＜0.05）。在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗體內APX 活性驟然下降。對比不同品種紫花苜蓿幼苗體內的APX 活性，發現降幅最大的品種是甘農3號，相比T1 處理，在T2處理和T3處理下，下降幅度分別為29%和91%；青大1 號幼苗體內APX 活性下降幅度最小，在T2處理和T3處理下，下降幅度分別為16%和77%。在T1處理下，各紫花苜蓿幼苗體內APX 活性表現為青大1 號＞中苜1 號＞甘農9 號＞中蘭2 號＞WL232＞大業1 號＞甘農3號；在T2處理下，各紫花苜蓿幼苗體內APX活性表現為青大1 號＞大業1 號＞中蘭2 號＞中苜1 號＞甘農9 號＞WL232＞甘農3 號；在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗體內APX活性表現為青大1號＞中蘭2號＞WL232＞中苜1號＞甘農9 號＞大業1 號＞甘農3 號。這說明適度的低溫處理可以很好地激活紫花苜蓿幼苗體內APX 活性，有助于清除活性氧給植物帶來的損傷，但是長時間低溫會使幼苗體內O2-·和H2O2大量積累，而積累的活性氧必將攻擊紫花苜蓿的植物膜，導致并加速冷害的發生，使APX 失活，不利于植物抵抗寒冷。

圖2 不同處理時間下不同品種紫花苜蓿APX 活性

2.3 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗脫氫抗壞血酸還原酶活性的影響

紫花苜蓿幼苗在4 ℃低溫脅迫過程中，DHAR 活性變化如圖3 所示。由圖3 可知，7 種紫花苜蓿幼苗在CK 處理下，即不經過低溫處理，幼苗體內DHAR活性處在一個較低的水平，但隨著低溫脅迫時間的延長，DHAR 活性呈上升趨勢。在T1處理下，大業1 號和WL232 幼苗體內DHAR 較活躍，增幅較CK 均達到了88%；各紫花苜蓿幼苗體內DHAR 活性表現為WL232＞大業1 號＞甘農9 號＞甘農3 號＞中苜1 號＞青大1 號＞中蘭2 號；在T2處理下，各紫花苜蓿幼苗體內DHAR 活性表現為青大1 號＞中蘭2 號＞中苜1 號＞大業1 號＞甘農9 號＞WL232＞甘農3 號；在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗中DHAR 活性表現為青大1 號＞中苜1 號＞中蘭2 號＞大業1 號＞WL232＞甘農9 號＞甘農3 號。這說明連續的長時間低溫處理使紫花苜蓿幼苗中活性氧大量聚集，破壞了苜蓿的細胞膜，苜蓿體內的DHAR 響應低溫脅迫。

圖3 不同處理時間下不同品種紫花苜蓿DHAR 活性

3 討論

3.1 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗中AAO 活性影響的探討

抗壞血酸氧化酶活性與植物的生長發育與抗衰老有著密切的關系，尤其是以葉片為收獲物的農作物，低溫可以降低農作物呼吸速率，抑制抗壞血酸氧化酶的活性，減緩抗壞血酸降解速度，還可減緩冷害發生[5]。

此次試驗結果表明，各紫花苜蓿幼苗體內AAO酶活性在低溫脅迫24 h 和48 h 處理下增幅較大，此時苜蓿開始受到低溫的迫害，苜蓿體內的抗氧化酶保護系統開始運作，產生AAO 以抵抗低溫的迫害。其中，青大1 號紫花苜蓿在低溫脅迫48 h 和72 h 處理下增幅驟然增加，說明隨著低溫脅迫時間的增加，苜蓿幼苗受傷嚴重，體內抗氧化酶系統加大運作力度產生大量的AAO，以減少低溫引起的傷害，且低溫脅迫時間越長，抗壞血酸氧化酶活性在青大1 號紫花苜蓿體內愈高。由此可見，青大1 號紫花苜蓿對低溫的響應比較好，比較適合種植在高寒地區，能夠很好地抵御冷害。

3.2 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗中APX 活性影響的探討

酶活性極易受到環境的影響，在低溫脅迫下，活性氧在苜蓿幼苗體內快速累積，導致脂膜過氧化，細胞受到損傷，此時苜蓿抗氧化酶系統中的APX 可以迅速有效清除活性氧，減輕低溫對植物的迫害[6-7]。此次試驗結果表明，在0～24 h 低溫脅迫下，紫花苜蓿幼苗體內APX 活性增幅最大，幼苗體內APX 對低溫脅迫的保護性應激反應極為敏感，在24 h 時幼苗體內抗氧化酶系統加大運作力度產生大量的APX，以減輕低溫對苜蓿造成的傷害。在24～48 h 低溫脅迫下，紫花苜蓿幼苗體內APX 活性升高，但增幅下降。低溫處理時間越長，苜蓿幼苗體內APX 活性越高，其體內的抗氧化酶系統越活躍，說明APX 是苜蓿幼苗體內用來抵抗低溫傷害的抗氧化酶系統中重要的一種保護酶。但隨著低溫脅迫時間的延長，幼苗體內會積累大量的和H2O2，會攻擊紫花苜蓿的植物膜，導致并加速冷害的發生，使APX 失活，不利于植物抵抗寒冷。此次試驗中，青大1 號紫花苜蓿在低溫脅迫下表現較好。

3.3 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗中DHAR 活性影響的探討

DHAR 存在于葉綠體、線粒體和細胞質中[8-9]。根據文獻報道，低溫鍛煉可使植物體內的AsA 含量隨著DHAR 活性的增強而增加[10-12]。在長期低溫脅迫處理下，紫花苜蓿體內會聚集大量活性氧，導致細胞膜損傷，從而使植物的抗寒性變弱。在良好的環境下，植物通常將活性氧維持在較低水平；而在周圍環境不利的情況下，如此次試驗低溫脅迫環境下，植物細胞代謝失調，體內活性氧水平升高，對細胞結構造成潛在威脅。而DHAR 是一種非常重要的酶，可以清除植物體內的活性氧，對逆境有著很好的響應。此次試驗結果表明，在0～72 h 低溫脅迫下，紫花苜蓿體內DHAR 活性總體先上升后下降。在低溫脅迫24 h后，DHAR 迅速在體內積累，在低溫脅迫48 h時，DHAR酶活性上升程度較為明顯，之后又在低溫脅迫72 h 后下降。不同品種、不同處理時間，紫花苜蓿幼苗體內DHAR 活性都要高于CK，但品種間的DHAR 活性差異性不顯著，其中青大1 號紫花苜蓿幼苗體內DHAR 活性最強，甘農3 號紫花苜蓿幼苗體內DHAR 活性最弱。

4 結論

此次試驗分析了不同品種紫花苜蓿在低溫脅迫下生理生化指標的變化，研究了不同品種紫花苜蓿的生理生化指標與其抗寒性的關系。結果表明，青大1 號紫花苜蓿對低溫的響應比較好，體內的AAO、APX、DHAR 活性增強，可有效清除由低溫帶來的活性氧，使細胞膜損傷程度下降，比較適合在高寒地區種植。