肺結核患者血清外泌體中差異表達的微小RNAs及其功能分析

邢 佳,曾婭莉,2,鄧建軍,2,3

(1.西南醫科大學附屬醫院醫學檢驗部,四川 瀘州 646000;2.四川綿陽四〇四醫院醫學檢驗科,四川 綿陽 621010;3.西南科技大學,四川 綿陽 621010)

結核病(Tuberculosis,TB)是機體通過多種途徑感染結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一類危害人類生命健康的傳染性慢性疾病,對全球人類健康影響重大[1-2]。MTB與其他常見細菌相比,雖無內外毒素和侵襲性酶,但其結構組分復雜,機體感染后的免疫機制尚不清晰,給相關研究帶來了困難[3]。外泌體(Exosomes,Exos)是一類大小在30～50 nm之間,可以被大多數細胞分泌到細胞外的具有雙層脂質結構的細胞外囊泡。Exos中攜帶有RNA(mRNA,miRNA,lncRNA和rRNA)、脂質、DNA、蛋白質和代謝物,這些物質都介導細胞與細胞的信號傳遞以及靶向作用的功能,因此Exos在疾病的發生發展中扮演重要角色[4-5]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種內源性非編碼的單鏈小分子,可以在轉錄后沉默基因表達,屬于介導MTB免疫機制與炎癥反應的重要RNA分子[6-7]。MTB感染后,外泌體分泌miRNA參與MTB免疫機制并起著重要的調控作用。以往關于miRNA與肺結核的關系研究主要是外周血中的miRNA表達差異分析,而對Exos中miRNA表達變化研究少有報道。因此,本文擬通過篩選肺結核患者血清外泌體差異表達的miRNA,探索miRNA在肺結核患者體內的信號通路調控作用,為結核病的診斷及發病機制的研究提供了潛在的可能。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 研究對象:收集2021年11月至2022年6月于四川綿陽四〇四醫院確診的肺結核患者血清樣本作為實驗組,同期選擇肺癌患者和健康體檢者血清樣本作為對照組。肺結核患者符合臨床肺結核病的診斷標準,肺癌患者符合臨床肺癌的診斷標準。所有標本取樣前均取得患者或家屬知情同意。

1.1.2 主要儀器與試劑:超速離心機購自ZIEISS公司;ZetaView PMX 粒徑檢測儀購自Metrix公司;透射電子顯微鏡購自日立公司;BCA 蛋白定量試劑盒購自生工生物有限公司;兔抗TSG101、鼠抗CD63 均購自Santa Cruz公司;血清外泌體總RNA提取試劑盒、UMI試劑盒均購自Qiagen公司;高通量測序平臺為Illumina HiSeq2500。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本采集:所有血清樣品均取自四川綿陽四〇四醫院,采用真空采血管(不含任何試劑)收集血樣,靜置(室溫,30 min)待上清析出后離心(5000 g,10 min),-80 ℃儲存。

1.2.2 分子排阻法及超濾離心法分離純化外泌體:血清樣本在37 ℃解凍,離心(3000 g,15 min)去除細胞碎片,上清用7倍體積 PBS 稀釋,離心(13000 g,離心30 min),再經0.22 μm濾膜過濾去除大顆粒。離心(100000 g,2 h,4 ℃),PBS重懸,離心(100000 g,2 h,4 ℃),再次 100 μl PBS重懸獲得外泌體,-80 ℃備用。

1.2.3 顆粒電位滴定及粒度分析儀進行粒徑檢測鑒定:粒子矩陣儀在波長為405 nm的激發光波下以30幀/s的幀速率拍攝60 s,將分離得到的外泌體進行濃度測定。PBS稀釋外泌體至1×107粒/ml至1×109粒/ml,NTA軟件分析粒子運動軌跡,并對其大小及質量進行測定,從而獲得外泌體的尺寸和濃度。

1.2.4 透射電鏡進行外泌體形態超微鑒定:將10 μl外泌體溶液滴于銅網上,靜置孵育(室溫,10 min)后用無菌蒸餾水清洗并吸干,之后滴上醋酸雙氧鈾(2%,10 μl)負染1 min,吸去浮液,干燥2 min(于白熾燈下靜置)后放置透射電鏡(80 kV)下觀察并拍照。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測外泌體表面標志物表達:先根據外泌體蛋白濃度(使用BCA蛋白定量試劑盒測定)確定外泌體上樣量(10～30 μg),之后加入一定比例緩沖液渦旋震蕩混勻后,95 ℃水浴5 min變性,于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,上樣量30 μg條件下蛋白電泳;電泳完成后將膠內目標區域蛋白電轉至PVDF膜;經3%BSA封閉液封閉,一抗、二抗孵育后,顯影,定影,曝光,并使用自動化學發光圖像分析(型號:Tanon4600)可視化標志物檢測結果。

1.2.6 高通量測序與分析外泌體miRNAs :使用miRNeasy Micro Kit試劑盒從外泌體懸浮液中提取總RNA,對提取樣本進行RNA質檢,UMI試劑盒建庫,于北京恩澤康泰有限公司進行高通量測序,采用TPM(Transcripts per million reads,TPM)歸一化處理各樣本中miRNAs的量,分析樣品間基因表達水平相關性。

1.2.7 miRNAs 靶基因預測及功能分析:miRNAs靶基因的預測分析使用RNA-hybrid、PITA、miRanda軟件,將3個分析結果中同時存在且表達差異的基因確定為各miRNAs的潛在靶基因;使用topGOR包(Gene ontology)對這類靶基因進行富集分析,使用軟件(http://www.genome.jp/kegg/)檢測KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析統計情況。

1.3 統計學方法 應用SPSS 20.0統計學軟件進行分析。KEGG分析采用超幾何檢驗;計量資料呈正態分布,組間比較采用獨立樣本t檢驗;P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清外泌體鑒定 分子排阻和超濾離心獲得的微囊泡直徑為30～100 nm、形態完整、球形、大小較為均一(圖1);實驗分析檢測樣本可見陽性蛋白標志物 TSG101、HSP70、CD63的表達,Calnexin 無表達,提示成功分離血清中外泌體(圖2)。

圖1 電鏡下外泌體大小形態(×20000倍)

圖2 外泌體標記物鑒定

2.2 測序數據過濾分類 通過質量控制,每個樣品的高質量序列平均為8.00M,miRNA長度集中于21～22個核苷酸,各樣本得到的總reads數為總sRNA。見表1。

表1 測序數據統計表

2.3 血清外泌體來源RNA高通量測序數據質量評估 結果顯示每個樣品測序錯誤率<0.5%,測序數據準確可靠(圖3)。

注:A為實驗組;B為肺癌對照組;C為健康人對照組圖3 實驗樣本測序錯誤率分布

2.4 miRNAs差異表達的篩選結果比較 與對照組相比,實驗組有63個miRNAs表達水平差異有統計學意義(P<0.05),其中上調表達 32個,下調表達31個,上調最顯著的10個miRNA及下調的顯著的10個miRNA。見表2。

表2 肺結核患者血清外泌體中差異顯著的miRNA分子

2.5 miRNAs靶基因功能分析 采用cluster Profiler對差異表達miRNA靶基因分別進行生物學過程,分子功能和細胞組分的富集分析。樣品間差異表達miRNA靶基因GO分類統計結果如下(圖4)。GO富集分析顯示,實驗組差異表達的miRNAs靶基因生物學過程方面主要富集于細胞組織代謝,細胞組分方面主要富集于細胞器和細胞質,分子功能方面主要富集于催化活性、核酸結合轉錄因子活性。

注:橫坐標為GO分類,縱坐標左邊為基因數目所占百分比,右邊為基因數目圖4 miRNA靶基因GO注釋分類統計圖

樣品間差異表達miRNA靶基因的通路注釋結果及分類圖見圖5、6;KEGG富集分析顯示,差異表達的miRNAs可顯著富集于腎素-血管緊張素系統(RAS)、轉化生長因子(TGF)、環腺苷酸單磷酸-蛋白激酶G(cGMP-PKG)等信號通路,并參與賴氨酸調節、甘油磷脂途徑及類固醇激素生物合成等代謝通路和蛋白質消化吸收、神經突觸囊泡循環等生物過程。

注:紅色框標記的酶是相關上調miRNA的靶基因,綠色為下調,藍色框標記的酶與上調和下調 miRNA的靶基因均有關圖5 差異表達miRNA靶基因的KEGG通路注釋示意圖

注:縱坐標為通路名稱,橫坐標為注釋到該通路下的基因個數及其占被注釋總數的比例圖6 血清外泌體差異表達miRNA基因

3 討 論

細胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是從細胞膜上脫落或釋放的小囊泡。根據其大小和生物起源,EV可分為凋亡小體、微粒/微泡和外泌體[8]。在這些EV類型中,外泌體的大小約為30～100 nm,通過核內體的形成,核內體向內萌發,引起多泡體的生物生成,外泌體與細胞膜融合,最終產生細胞外泌體的釋放[9-10]。

越來越多的研究表明各種細胞釋放的外泌體可以作為不同細胞之間信息交換的介質,不同來源的的外泌體膜內外所含成分有很大區別,其功能亦不盡相同。許多研究已經報道了外泌體miRNA分子在不同系統疾病中的功能,包括心血管[11]、神經系統[12]和泌尿系統[13]等多種疾病,特別是這些系統中的惡性腫瘤,明確其作用機制后可作為診斷標志物加以應用。以往的研究更關注miRNA在腫瘤中的機制及作為標志物的臨床前景。但在外界環境中,miRNA分子極易降解,某種程度上,外泌體可為細胞外miRNAs的穩定提供保護作用[14]。此外,供體細胞釋放的外泌體中的miRNA可被受體細胞吸收并調節這些細胞中的基因表達,使其用于腫瘤診斷或者治療成為可能[15]。 在不同的生理和病理條件下,miRNAs的表達模式不同,這可能意味著這些外泌體生物分子具有反映疾病狀態的潛力。在呼吸系統疾病方面新的研究表明,外泌體miRNAs在肺癌、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、肺結核(TB)和間質性肺疾病(ILD)發病機制中發揮重要進展作用,許多肺部疾病患者的外泌體miRNA譜與健康人不同,因而顯示出作為診斷生物標志物和治療靶點的前景[16]。在肺結核方面,目前對結核病外泌體的研究還未清晰,已經發現[17]感染Mtb的巨噬細胞可以將負載在外泌體中的特定miRNAs釋放到細胞外空間。研究證明[18],牛分枝桿菌Calmette-Guérin(BCG)感染的單核細胞來源的巨噬細胞能夠釋放多種特異性的外泌體miRNA,如miR-484、miR-425、miR-5094等。另一項研究發現,巨噬細胞中的結核分枝桿菌感染可以抑制外泌體中特異性miRNAs的包封,這些miRNAs似乎可以調節與免疫監視和炎癥相關的靶基因。據報道[19],被Mrb感染的巨噬細胞的外泌體包含一組獨特的宿主miRNAs和分枝桿菌RNA,它們在結核分枝桿菌感染過程中發揮作用,并有望作為結核病的診斷生物標志物。

本研究通過提取肺結核患者血清中Exos,分離純化miRNA并分析miRNA表達譜變化,發現肺結核患者血清外泌體miRNA表達與肺癌對照組和健康人對照組有著顯著的統計學差異,采用 GO分析富集了解這些差異miRNA 靶基因可能具有的調節功能和具體分子機制。并用KEGG分析了其主要信號通路,發現于RAS、TGF、cGMP-PKG等信號通路均有上調的miRNA靶基因顯著富集,而下調的miRNA靶基因主要參與賴氨酸調節、甘油磷脂途徑及類固醇激素生物合成等代謝通路,且這些上調或下調的miRNA靶基因均參與蛋白質消化吸收、神經突觸囊泡循環等生物過程。可見,肺結核病的發生發展與Exos中miRNA的差異表達有一定的相關性。因此,本研究為肺結核提供了的新的生物標志物和潛在治療靶點,并為更好地理解該疾病的理論基礎提供了理論依據,提供了更好的深入研究的方向,有助于更好地理解該疾病的病因。一些報道較少的外泌體miRNA仍需要大量同類數據進行補充驗證及后續進一步實驗研究,以此為肺結核相關分子標志物的篩選和研究提供更可靠的依據,我們將在后續的實驗中繼續挖掘,更全面的揭示外泌體miRNA在肺結核中的作用。