人參皂苷Rg1 通過Sestrin2 保護心肌細胞的作用

劉 燃，林 志，楊 帆，段繼坤

（昆明醫科大學第二附屬醫院心血管內科三病區，云南 昆明 650031）

在心肌缺血后血運重建的過程會引起心肌損傷，這種現象被稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial reperfusion injury，MRI）。研究認為氧化應激、鈣超載、PH 快速校正、炎癥反應、線粒體膜通透性轉運孔開放是心肌缺血再灌注損傷的主要發病機制。人參皂苷Rg1（ginsenoside-Rg1，G-Rg1）為四環三萜類衍生物，是人參、三七等人參屬藥材的主要活性成分之一。以往研究發現，G-Rg1 可抑制鈣敏感蛋白和鈣調磷酸酶表達，減少細胞內Ca2+超載，緩解心肌細胞肥大及纖維化[1]。G-Rg1 可以抑制心肌細胞凋亡，減少心肌梗死面積[2]。Sestrin2 作為Sestrins 家族蛋白的一員，具有抗氧化應激的作用。研究發現，Sestrin2 可通過激活AMPK 通路，減輕心肌缺血損傷[3]。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與很多心血管疾病有關。輕度心肌損傷或心肌損傷早期，ERS 可減輕心肌細胞病理應激。然而，過度的 ERS 可導致心肌細胞凋亡[4]。ERS 與Sestrin2 表達調節密切相關，ERS 誘導Sestrin2 表達上調，而Sestrin2 表達可緩解ERS 應激相關性疾病[5]。同時有研究證明血液循環中的Sestrin2水平可在一定范圍內表明心血管疾病嚴重程度或預后[6-8]。

但目前關于ERS 和Sestrin2 在G-Rg1 保護MRI 心肌中的作用，以及ERS 和Sestrin2 相互作用關系，鮮有報道。本研究擬通過模擬大鼠胚胎細胞株（H9C2）的缺血再灌注損傷模型，從分子、細胞層面研究ERS 和Sestrin2 在G-Rg1 緩解MRI 心肌細胞損傷中的作用，及其分子間相互作用關系。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 主要儀器及試劑Accuri C6 流式細胞儀（美國 BD 公司）；凝膠成像儀（Tanon）、垂直電泳槽（BIO-RAD）；濕式轉膜槽，（BIO-RAD）；普通培養箱及三氣培養箱（Theromo electron Corporation，美國）；正置熒光顯微鏡（奧林巴斯 BX53）；大鼠心肌細胞（H9c2 細胞）購買于北納生物 ；GRg1（sigma 68 317）；活性氧檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；HIF-1α 單抗（bioss bs-20399R）、ATF-6 單抗（bioss bs-1634R）；PERK單抗（bioss bs-2469R）、IRE-1 單抗（abcam ab37073）、Sestrin2 單抗（abcam ab178518）、肌動蛋白單抗（中杉金橋）；HRP 標記通用型二抗（goat 來源，CST）;純化熒光單抗（Affinuty purified Antibody Daylight 488 Labeled Goat anti-Rabbit IgG（H+L），購自KPL）；Sestrin2 siRNA 轉染試劑盒（銳博）;HIF-1α 抑制劑（abcam ab141642）。

1.1.2 Sestrin2 siRNA 轉染H9C2 細胞按照轉染試劑盒說明書篩選出最佳的siRNA-Sestrin2 序列供后續轉染使用。siRNA 轉染方法：以riboFECT? CP 作為轉染試劑，轉染濃度為50 nM。根據轉染試劑盒說明書制備 riboFECT? CP 混合液。按照分組將制備好的混合液加入6 孔培養板中，酒精噴灑后放入培養箱。48 h 轉染完成，可進行后續實驗。

1.1.3 實驗分組及處理使用10%小牛血清DMEM/F12 高糖培養液培養 H9c2 細胞，以 1×109/L 接種于底面積 25 cm2培養瓶中，將細胞置于37 ℃，5% CO2培養箱中，每隔2 d 傳代。當細胞密度達80%～90% 時，隨機分5 組。對照組：將高糖培養液置換為無糖無血清培養基繼續培養，不作任何處理；缺氧復氧組：無糖無血清培養基培養細胞2 h，除去溶解氧。再將H9C2 細胞置于5%CO2和92% N2、3% O2的培養箱中，在37 ℃下誘導缺氧3 h，持續監測培養箱內氧含量（3% O2），以保持穩定的缺氧水平。最后更換成正常含血清的細胞培養液，在正常培養條件下復氧處理 4 h，構建缺氧復氧心肌細胞損傷模型；G-Rg1 組：用無糖無血清培養基培養細胞2 h，除去溶解氧，而后加入10 μmol/L G-Rg1，最后將H9C2 細胞進行缺氧復氧處理，處理方法同上；HIF-1α 抑制劑組：用無糖無血清培養基培養細胞2 h，除去溶解氧，而后使用10 μmol/L HIF-1α 抑制劑處理細胞 15 min，再加入10 μmol/L G-Rg1，然后進行缺氧復氧處理，處理方法同上；Sestrin siRNA 組：將經過Sestrin siRNA 轉染細胞的高糖培養液置換為無糖無血清培養基，而后加入10 μmol/L G-Rg1處理細胞，最后進行缺氧復氧處理。

1.1.4 活性氧ROS 檢測方法吸掉培養板中原培養基，加入含有1∶1 000 稀釋DCFH-DA 的基礎培養基；37 ℃培養箱孵育20 min，用無血清培養基洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。0.25%胰酶消化1～2 min 左右，當發現細胞收縮成球狀或呈流沙狀時應立即加入0.5 mL 新鮮的完全培養基終止消化；將細胞懸液移至新離心管中，1 000 r/min 離心3 min 收集細胞。流式細胞儀檢測細胞ROS 水平。用ROS 陽性細胞所占百分比表示各組心肌細胞中ROS 水平。

1.1.5 蛋白質免疫印跡法提取蛋白質并定量，進行 SDS-PAGE 電泳，而后使用PVDF 膜進行濕轉法轉膜，完成后將膜置入5%牛血清白蛋白中，室溫封閉1 h；TBST 洗膜3 次后加入1∶1 000 稀釋的一抗，孵育 12 h ；除去一抗，TBST 洗膜3次后加入1∶2 000 稀釋的二抗，室溫孵育2 h；除去二抗，TBST 洗膜3 次后進行化學發光、顯影、定影。用凝膠成像儀掃描圖像，以GAPDH 為內參，使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.1.6 細胞免疫熒光染色PBS 浸洗培養板中已爬好細胞爬片3 次；4%的多聚甲醛室溫固定爬片30 min；PBS 漂洗3 次，每次5 min；0.2%Triton X-100 室溫通透20 min；PBS 漂洗3 次，每次5 min；用5%羊血清室溫封閉 60 mins；除去封閉液，加合適濃度的第一抗體，4 ℃冰箱過夜；PBST 漂洗4 次，每次5 min；加入合適濃度的熒光標記二抗，避光、室溫孵育2 h；PBST 避光漂洗4 次，每次5 min；除去多余水滴，每張細胞爬片上滴加50 μl 含DAPI 的抗淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.2 統計學處理

實驗所得數據均采用Prism 8.0 軟件進行統計分析。計量資料數據經正態檢驗均為正態分布（P＞ 0.05），用均數 ± 標準差（）表示，采用單因素方差分析多組間差異。P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌細胞中ROS 水平比較

流式細胞術分析顯示：與對照組比較，缺氧復氧組細胞內ROS 水平明顯上調[（67.73±3.70）%，（89.19±1.44）%，P＜ 0.01]；與缺氧復氧組比較，G-Rg1 組細胞內ROS 水平明顯降低[（89.19±1.44）%，（72.64±1.67）%，P＜ 0.01]；與G-Rg1 組比較，HIF-1α 抑制劑組、Sestrin2 siRNA 干擾組心肌細胞內ROS 水平上升[（72.64±1.67）%，（89.69±2.90）%，P＜ 0.01]、[（72.64±1.67）%，（87.75±3.29）%，P＜ 0.01]，見圖1。

2.2 各組心肌細胞HIF-1-α、Sestrin2 蛋白表達及內質網跨膜蛋白：ATF-6、PERK、IRE-1 表達的比較

Western blot 檢測結果顯示，與對照組比較，缺氧復氧組細胞HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1 蛋白表達均升高，P＜ 0.05；與缺氧復氧組比較，G-Rg1 組細胞HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1 蛋白表達均升高，P＜ 0.05；與G-Rg1組比較，HIF-1α 抑制劑組細胞Sestrin2 蛋白表達明顯下調，P＜ 0.05，其余蛋白表達差異無統計學意義；與G-Rg1 組比較，siRNA 干擾組心肌細胞IRE-1 表達明顯上調，P＜0.05，其余蛋白表達差異無統計學意義，見圖2。

圖2 各組心肌細胞 HIF-1α、Sestrin2 蛋白表達及內質網跨膜蛋白：ATF-6、PERK、IRE-1 表達Fig.2 The protein expression of HIF-1α，Sestrin2，ATF-6，PERK，IRE-1 in cardiomyocytes

2.3 免疫熒光檢測各組HIF-1-α、Sestrin2 及內質網跨膜蛋白

ATF-6、PERK、IRE-1，檢測結果與western blot 檢測結果具有一致性，見圖3。

3 討論

已有研究證明G-Rg1 可抑制血管內皮細胞氧化應激、衰老；恢復MRI 心肌細胞中 ATP 的產生，對心血管具有保護作用[9-10]。發生MRI 時，細胞快速產生大量ROS，進而加重損傷。ROS 是MRI 損傷發生的關鍵因素[11]。

細胞受到外部刺激，如營養不足、缺氧、缺血、氧化應激、DNA 損傷，導致錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白在細胞內質網腔內堆積、鈣超載、脂肪代謝異常，內質網平衡穩態遭到破壞，最終引起內質網應激。內質網應激信號轉導是通過3 種關鍵酶介導的：PERK、ATF-6 和IRE1[4]。Joshua J Martindale 等[12]發現，ATF-6 對心肌細胞具有保護作用。ATF-6 可誘導具有細胞保護性的內質網應激蛋白表達，如GRP78 和GRP94。ATF-6 轉基因小鼠心肌細胞，在缺血再灌注后具有更好的功能恢復性，同時細胞壞死和凋亡明顯減少[12]。Yongxue Ruan 等[13]發現，缺血早期，內質網被激活對心肌細胞具有保護作用，然而到了后期，內質網應激主要引起細胞凋亡。內質網應激發揮不同功能主要取決于ATF-6，PERK 和IRE-1 蛋白活化的程度和內質網應激的性質。

研究發現哺乳動物Sestrins 的亞型分別是Sestrin1、Sestrin2、Sestrin3。Sestrins 可在缺氧、氧化應激、饑餓、DNA 損傷等各種應激條件誘導下表達升高。目前對Sestrin2 的研究最為廣泛，Sestrin2 可通過激活AMPK、抑制mTOR 信號通路，誘導細胞自噬，進而減少細胞內ROS 累積，調節細胞內穩態[5]。Yunxia Liu 等[14]發現，Sestrin2 可通過激活AMPK，減少ROS，抑制P38、ERK、JNK 磷酸化，減少缺氧再灌注心臟梗死面積，改善心肌細胞收縮性，保護心肌細胞。Park HW 等研究發現，ERS 與Sestrin2 表達調節密切相關，ERS 誘導Sestrin2 表達上調，而Sestrin2表達可緩解ERS 應激相關性疾病。Sestrin2 主要通過調節AMPK-mTORC1 蛋白信號通路維持內質網應激平衡穩態[15]。Li-Xue Wang 等[16]研究發現，Sestrin2 通過抑制PERK-ATF4-CHOP 信號通路，減少因內質網應激導致的樹突狀細胞凋亡。然而，Sestrin2 作為反饋調劑因子，緩解內質網應激所致細胞損傷的具體機制，目前仍不清楚。ERS 時活化的IRE-1 具有內切核糖核酸酶的活性，對下游XBP1 mRNA 進行剪接，產生活性轉錄因子XBP1s，上調內質網相關基因表達。長時間活化IRE-1，可通過活化TRAF2/ASK1/JNK 信號通路，促進細胞凋亡[4]。

當細胞處于缺血缺氧狀態時可表達多種基因，其中缺氧誘導因子1α（Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1）可作為重要的轉錄因子，調節靶基因的表達。HIF-1α 可通過上調一氧化氮合成酶（iNOS）、血紅素（HO-1）、環加氧酶2（COX-2）、抗氧化酶緩解心肌細胞缺氧復氧損傷[17]。Essler S 等[18]研究證明HIF-1α 可誘導活化Sestrin2。但是在癌細胞里則出現了不一樣的調節關系，Sestrin2 可以通過下調哺乳動物雷帕霉素復合物1（mTORC1）和缺氧誘導因子1-α（HIF-1α）靶標來強烈抑制致癌信號通路，亦可被缺氧誘導因子-1（HIF-1）轉錄激活，同時在一定條件下，Sestrin2降低T 細胞和自然殺傷細胞的細胞毒性活性，這有助于腫瘤細胞免疫逃避[19-20]。

本研究通過大鼠胚胎細胞株（H9C2）的缺血再灌注損傷模型，從分子、細胞層面研究在G-Rg1緩解急性心肌MRI 中HIF-1α、ERS 和Sestrin2相互作用關系。本研究發現，與對照組相比，GRg1 處理后，缺氧復氧心肌細胞內ROS 含量明顯降低，再次證明，G-Rg1 對缺氧復氧心肌細胞具有保護作用。經G-Rg1 處理的缺氧復氧心肌細胞，HIF-1α、Sestrin2 表達上調。抑制HIF-1α 或沉默Sestrin2 基因，G-Rg1 對ROS 的抑制作用明顯減少。因此筆者認為，HIF-1α 和Sestrin2 在GRg1 保護MRI 心肌細胞的相關機制中起關鍵作用，緩解心肌細胞所受缺氧復氧損傷。同時G-Rg1 可促進缺氧復氧心肌細胞內質網應激，細胞內ATF-6、PERK、IRE-1 表達升高。此外，筆者發現，沉默細胞Sestrin2 基因，G-Rg1 處理的缺氧復氧心肌細胞，IRE-1 表達明顯上調，PERK、ATF-6蛋白表達無明顯變化，Sestrin2 通過抑制IRE-1過度表達，維持內質網應激平衡穩態，減少由內質網應激引起的心肌細胞凋亡。抑制HIF-1α，G-Rg1 對Sestrin2 的促表達作用受到部分抑制。然而是否沉默Sestrin2 基因，并不影響G-Rg1 對HIF-1α 的作用；抑制HIF-1α 前后，G-Rg1 對ATF-6、PERK、IRE-1 蛋白表達無明顯變化。由此我們認為，G-Rg1 可通過HIF-1α 上 調Sestrin2 表達，進而保護心肌細胞。而G-Rg1 能否通過其它信號通路上調Sestrin2 表達目前尚無相關研究證明。

本研究均為體外實驗，只涉及一種心肌細胞系，研究具有一定局限性，后續將通過體內實驗進一步豐富并完善實驗證據。此外，ERS 對HIF-1α 和Sestrin2 的作用及相關機制，仍需后續實驗進行深入探究。