低溫脅迫對紫花苜蓿幼苗AsA酶活性的影響

馬亞珺 楊國柱 田海寧

摘 要 為研究低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿體內(nèi)抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）酶活性的影響，選育出適宜在青海省高寒地區(qū)種植的紫花苜蓿品種，以青大1號、大業(yè)1號、中苜1號、中蘭2號、甘農(nóng)3號、甘農(nóng)9號和WL232這7個品種為試驗對象，設(shè)置0 h（CK）、24 h（T1）、48 h（T2）、72 h（T3）4個低溫處理，并測定紫花苜蓿幼苗中的抗壞血酸氧化酶（Ascorbate oxidase，AAO）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase，DHAR）的活性。結(jié)果表明，紫花苜蓿幼苗中酶活性極易受到環(huán)境的影響，且苜蓿品種不同、處理時長不同，幼苗體內(nèi)酶活性不同，但在處理一定時間后，幼苗體內(nèi)酶活性會減弱并趨于一個穩(wěn)定值。其中，AAO、APX、DHAR活性最高的品種是青大1號紫花苜蓿，比較適宜在青海省高寒地區(qū)推廣種植。

關(guān)鍵詞 紫花苜蓿；低溫脅迫；抗壞血酸氧化酶；抗壞血酸過氧化物酶；脫氫抗壞血酸還原酶

中圖分類號：S541.9 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.08.001

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是多年生豆科牧草，根系發(fā)達，主根粗大，抗寒性、抗旱性和可再生能力較為強大，且產(chǎn)草量高，富含蛋白質(zhì)，適口性好，固氮能力強，適應(yīng)性廣，被稱為“牧草之王”[1-2]。在植物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的抗氧化物中，抗壞血酸含量最為豐富，抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）又名維生素C，常起到抗氧化和輔助7-α-羥化酶促進膽固醇轉(zhuǎn)化膽汁酸的作用，是植物和大多數(shù)生物體內(nèi)重要的抗氧化劑，在生長發(fā)育過程中起著重要作用。在高等植物中，抗壞血酸氧化酶（Ascorbate oxidase，AAO）是一種含銅的酶，位于細胞質(zhì)中或與細胞壁結(jié)合，與其他氧化還原反應(yīng)相偶聯(lián)作為末端氧化酶，能催化抗壞血酸的氧化，具有抗衰老等作用；抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一，又是維生素C代謝的主要酶類，紫花苜蓿中豐富的維生素C是飼草中重要活性營養(yǎng)成分[3]；脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）是調(diào)控植物體內(nèi)AsA氧化還原態(tài)的關(guān)鍵酶，在循環(huán)利用AsA、維持植物體內(nèi)AsA的正常代謝水平、保護細胞組分抵御氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、儀器、試劑

1.1.1 試驗材料

試驗材料為青大1號、大業(yè)1號、中苜1號、中蘭2號、甘農(nóng)3號、甘農(nóng)9號和WL232紫花苜蓿幼苗。

1.1.2 試驗儀器

試驗儀器有培養(yǎng)皿、人工氣候箱、分析天平、研缽、50 mL量筒、50 mL三角瓶、微量滴定管、滴定架、離心機、恒溫水浴槽、洗耳球、酶標(biāo)板、EP管及紫外分光光度計等。

1.1.3 試驗試劑

試驗試劑有碘酸鉀、冰醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、抗壞血酸、淀粉溶液、乙醇、偏磷酸、三氯乙酸、雙蒸水及牛血清蛋白等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料的準(zhǔn)備

采用盆栽試驗，選用大小均勻、顆粒飽滿的紫花苜蓿種子，將其用75%的乙醇溶液消毒后，播種在標(biāo)記好的花盆中，每盆播種50粒，每個品種播種12盆。將播種好的花盆置于人工氣候室內(nèi)進行培養(yǎng)，溫度保持在25 ℃。于播種后90 d進行試驗。

1.2.2 試驗實施

在進行低溫處理時，將人工氣候室溫度調(diào)至4 ℃，同時設(shè)置脅迫時間，共設(shè)置0 h（CK）、24 h（T1）、48 h（T2）、72 h（T3）4個處理，并分別測定紫花苜蓿AsA酶活性。

1.2.3 項目測定

采用碘量法測定抗壞血酸氧化酶活性、采用紫外吸收法測定抗壞血酸過氧化物酶活性、采用微量法測定脫氫抗壞血酸還原酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2010和SPSS 26.0軟件進行繪圖與統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗抗壞血酸氧化酶活性的影響

紫花苜蓿幼苗在4 ℃低溫脅迫過程中，AAO活性變化如圖1所示。由圖1可知，隨著處理時間的延長，T2、T3處理紫花苜蓿幼苗體內(nèi)AAO活性呈上升趨勢。在T3處理下，青大1號AAO活性顯著高于其他品種（p<0.05）。在T1處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)AAO活性表現(xiàn)為WL232>青大1號>大業(yè)1號>中苜1號>中蘭2號>甘農(nóng)9號>甘農(nóng)3號；在T2處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)AAO活性表現(xiàn)為青大1號>WL232>甘農(nóng)9號>中苜1號>大業(yè)1號>中蘭2號>甘農(nóng)3號；在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)AAO活性表現(xiàn)為青大1號>甘農(nóng)9號>WL232>中苜1號>大業(yè)1號>中蘭2號>甘農(nóng)3號。這表明低溫脅迫可促進紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的AAO發(fā)揮作用，清除植物體內(nèi)聚集的活性氧，使種植在高寒地區(qū)的紫花苜蓿能夠很好地抵御冷害。

2.2 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗抗壞血酸過氧化物酶活性的影響

紫花苜蓿幼苗在4 ℃低溫脅迫過程中，APX活性變化如圖2所示。由圖2可知，7個品種紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的APX活性在T1處理下達到高峰，隨后逐漸呈現(xiàn)下降趨勢。在T2處理下，只有甘農(nóng)3號幼苗體內(nèi)APX活性顯著低于其他紫花苜蓿品種（p<0.05）。在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX活性驟然下降。對比不同品種紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的APX活性，發(fā)現(xiàn)降幅最大的品種是甘農(nóng)3號，相比T1處理，在T2處理和T3處理下，下降幅度分別為29%和91%；青大

1號幼苗體內(nèi)APX活性下降幅度最小，在T2處理和T3處理下，下降幅度分別為16%和77%。在T1處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX活性表現(xiàn)為青大1號>中苜1號>甘農(nóng)9號>中蘭2號>WL232>大業(yè)1號>甘農(nóng)

3號；在T2處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX活性表現(xiàn)為青大1號>大業(yè)1號>中蘭2號>中苜1號>甘農(nóng)9號>

WL232>甘農(nóng)3號；在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX活性表現(xiàn)為青大1號>中蘭2號>WL232>中苜1號>

甘農(nóng)9號>大業(yè)1號>甘農(nóng)3號。這說明適度的低溫處理可以很好地激活紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX活性，有助于清除活性氧給植物帶來的損傷，但是長時間低溫會使幼苗體內(nèi)O2-·和H2O2大量積累，而積累的活性氧必將攻擊紫花苜蓿的植物膜，導(dǎo)致并加速冷害的發(fā)生，使APX失活，不利于植物抵抗寒冷。

2.3 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗脫氫抗壞血酸還原酶活性的影響

紫花苜蓿幼苗在4 ℃低溫脅迫過程中，DHAR活性變化如圖3所示。由圖3可知，7種紫花苜蓿幼苗在CK處理下，即不經(jīng)過低溫處理，幼苗體內(nèi)DHAR活性處在一個較低的水平，但隨著低溫脅迫時間的延長，DHAR活性呈上升趨勢。在T1處理下，大業(yè)1號和WL232幼苗體內(nèi)DHAR較活躍，增幅較CK均達到了88%；各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)DHAR活性表現(xiàn)為WL232>大業(yè)1號>甘農(nóng)9號>甘農(nóng)3號>中苜1號>青大1號>中蘭2號；在T2處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)DHAR活性表現(xiàn)為青大1號>中蘭2號>中苜1號>大業(yè)1號>甘農(nóng)9號>WL232>甘農(nóng)3號；在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗中DHAR活性表現(xiàn)為青大1號>中苜1號>中蘭2號>大業(yè)1號>WL232>甘農(nóng)9號>甘農(nóng)3號。這說明連續(xù)的長時間低溫處理使紫花苜蓿幼苗中活性氧大量聚集，破壞了苜蓿的細胞膜，苜蓿體內(nèi)的DHAR響應(yīng)低溫脅迫。

3 討論

3.1 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗中AAO活性影響的探討

抗壞血酸氧化酶活性與植物的生長發(fā)育與抗衰老有著密切的關(guān)系，尤其是以葉片為收獲物的農(nóng)作物，低溫可以降低農(nóng)作物呼吸速率，抑制抗壞血酸氧化酶的活性，減緩抗壞血酸降解速度，還可減緩冷害發(fā)生[5]。

此次試驗結(jié)果表明，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)AAO酶活性在低溫脅迫24 h和48 h處理下增幅較大，此時苜蓿開始受到低溫的迫害，苜蓿體內(nèi)的抗氧化酶保護系統(tǒng)開始運作，產(chǎn)生AAO以抵抗低溫的迫害。其中，青大1號紫花苜蓿在低溫脅迫48 h和72 h處理下增幅驟然增加，說明隨著低溫脅迫時間的增加，苜蓿幼苗受傷嚴重，體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)加大運作力度產(chǎn)生大量的AAO，以減少低溫引起的傷害，且低溫脅迫時間越長，抗壞血酸氧化酶活性在青大1號紫花苜蓿體內(nèi)愈高。由此可見，青大1號紫花苜蓿對低溫的響應(yīng)比較好，比較適合種植在高寒地區(qū)，能夠很好地抵御冷害。

3.2 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗中APX活性影響的探討

酶活性極易受到環(huán)境的影響，在低溫脅迫下，活性氧在苜蓿幼苗體內(nèi)快速累積，導(dǎo)致脂膜過氧化，細胞受到損傷，此時苜?？寡趸赶到y(tǒng)中的APX可以迅速有效清除活性氧，減輕低溫對植物的迫害[6-7]。此次試驗結(jié)果表明，在0～24 h低溫脅迫下，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX活性增幅最大，幼苗體內(nèi)APX對低溫脅迫的保護性應(yīng)激反應(yīng)極為敏感，在24 h時幼苗體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)加大運作力度產(chǎn)生大量的APX，以減輕低溫對苜蓿造成的傷害。在24～48 h低溫脅迫下，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX活性升高，但增幅下降。低溫處理時間越長，苜蓿幼苗體內(nèi)APX活性越高，其體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)越活躍，說明APX是苜蓿幼苗體內(nèi)用來抵抗低溫傷害的抗氧化酶系統(tǒng)中重要的一種保護酶。但隨著低溫脅迫時間的延長，幼苗體內(nèi)會積累大量的O2-·和H2O2，會攻擊紫花苜蓿的植物膜，導(dǎo)致并加速冷害的發(fā)生，使APX失活，不利于植物抵抗寒冷。此次試驗中，青大1號紫花苜蓿在低溫脅迫下表現(xiàn)較好。

3.3 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗中DHAR活性影響的探討

DHAR存在于葉綠體、線粒體和細胞質(zhì)中[8-9]。根據(jù)文獻報道，低溫鍛煉可使植物體內(nèi)的AsA含量隨著DHAR活性的增強而增加[10-12]。在長期低溫脅迫處理下，紫花苜蓿體內(nèi)會聚集大量活性氧，導(dǎo)致細胞膜損傷，從而使植物的抗寒性變?nèi)?。在良好的環(huán)境下，植物通常將活性氧維持在較低水平；而在周圍環(huán)境不利的情況下，如此次試驗低溫脅迫環(huán)境下，植物細胞代謝失調(diào)，體內(nèi)活性氧水平升高，對細胞結(jié)構(gòu)造成潛在威脅。而DHAR是一種非常重要的酶，可以清除植物體內(nèi)的活性氧，對逆境有著很好的響應(yīng)。此次試驗結(jié)果表明，在0～72 h低溫脅迫下，紫花苜蓿體內(nèi)DHAR活性總體先上升后下降。在低溫脅迫24 h后，DHAR迅速在體內(nèi)積累，在低溫脅迫48 h時，DHAR酶活性上升程度較為明顯，之后又在低溫脅迫72 h后下降。不同品種、不同處理時間，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)DHAR活性都要高于CK，但品種間的DHAR活性差異性不顯著，其中青大1號紫花苜蓿幼苗體內(nèi)DHAR活性最強，甘農(nóng)3號紫花苜蓿幼苗體內(nèi)DHAR活性最弱。

4 結(jié)論

此次試驗分析了不同品種紫花苜蓿在低溫脅迫下生理生化指標(biāo)的變化，研究了不同品種紫花苜蓿的生理生化指標(biāo)與其抗寒性的關(guān)系。結(jié)果表明，青大1號紫花苜蓿對低溫的響應(yīng)比較好，體內(nèi)的AAO、APX、DHAR活性增強，可有效清除由低溫帶來的活性氧，使細胞膜損傷程度下降，比較適合在高寒地區(qū)

種植。

參考文獻：

[1] 蔣志剛，李立立，胡一鳴，等.青藏高原有蹄類動物多樣性和特有性：演化與保護[J].生物多樣性，2018，26（2）：158-170.

[2] 張鐿鋰，吳雪，祁威，等.青藏高原自然保護區(qū)特征與保護成效簡析[J].資源科學(xué)，2015，37（7）：1455-1464.

[3] 段保寧，張晶晶.苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及展望[J].今日畜牧獸醫(yī)，2019，35（6）：74-75.

[4] 郭正剛，張自和，王鎖民，等.不同紫花苜蓿品種在黃土高原丘陵區(qū)適應(yīng)性的研究[J].草業(yè)學(xué)報，2003，12（4）：45-50.

[5] 洪紱曾.中國草業(yè)戰(zhàn)略研究的必要性和迫切性[J].草地學(xué)報，2005，13（1）：1-4.

[6] 王英哲，徐博，徐安凱，等.14個紫花苜蓿品種的引種和生產(chǎn)性能比較評價[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2015，31（11）：38-44.

[7] 王運濤，楊志敏，李廣有，等.6個苜蓿品種在冀西北地區(qū)的生產(chǎn)性能[J].草業(yè)科學(xué)，2014，31（6）：1141-1146.

[8] 徐麗君，楊桂霞，陳寶瑞，等.不同苜蓿（品）種營養(yǎng)價值的比較[J].草業(yè)科學(xué)，2013，30（4）：566-570.

[9] 楊紅善，常根柱，周學(xué)輝，等.苜蓿引進品種半干旱、半濕潤區(qū)適應(yīng)性試驗[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，20（1）：86-90.

[10] 薛琪.8個紫花苜蓿品種抗旱、抗寒性分析研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2017.

[11] 劉佳月.紫花苜蓿與黃花苜?？购缔D(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2018.

[12] 段明.低溫脅迫下番茄類囊體膜抗壞血酸過氧化物酶基因的表達和功能研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

（責(zé)任編輯：張春雨）