馬蘭草凝膠貼劑對肝硬化腹水大鼠及其活化肝星狀細胞凋亡的影響研究

梁光萍 高玲 陳曉蘭 張寧 羅樂 李嘉

腹水是肝硬化由代償期進入失代償期的典型并發癥之一,一旦腹水形成,患者第1年和第5年的病死率分別約為15%和44%～85%[1]。腹水發病機制尤為復雜,與門脈高壓、血漿膠體滲透壓降低、淋巴液增多、醛固酮系統活性增強等有關[2],其中門脈高壓被認為是導致肝硬化腹水形成的始動和關鍵因素。而在門脈高壓中,活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)是門脈高壓形成的中心環節[3-4],故誘導活化的HSC發生凋亡,是治療肝硬化腹水的一個重要靶點。

馬蘭草為菊科植物,民間道地藥材,有抗炎、鎮痛、保肝等作用,其味辛性寒、涼,有清熱解毒、理氣消腫、涼血、利濕功效。課題組前期通過臨床研究初步發現采用口服健脾活血祛濕方聯合馬蘭草臍灸,能改善肝硬化腹水患者肝功能指標和腹水量,緩解腹脹等[5]。基礎研究方面,采用馬蘭草臍灸治療肝纖維化模型大鼠能有效改善肝纖維化程度[6-7],且在體外實驗中驗證了馬蘭提取物對活化的HSC-T6有促凋亡的功效[8]。鑒于前期研究成果,本研究將馬蘭草制備成凝膠貼劑,以貼敷臍療法為干預方法,通過觀察肝硬化腹水大鼠的一般情況、腹水量改變、肝組織病理變化、及相關B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2關聯X(Bcl-2 associated X,Bax)因子的表達變化,探索治療肝硬化腹水大鼠可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

60只SPF級健康Wistar雄性大鼠,6周齡,體質量180～200g,購自長沙市天勤生物技術有限公司,合格證號:SCXK(湘)2019-0014。自由飲水飲食,12小時/12小時的光暗循環,環境溫度(22±3)℃,相對濕度(50±10)%。

1.2 實驗藥物

馬蘭草采摘于貴州畢節,經貴州中醫藥大學生藥實驗室田源紅教授鑒定為菊科植物馬蘭[Kalimerisindica(L.)Sch-Bip]的帶根全草。稱取馬蘭草粉末200 g(過3號篩),加10倍量70%乙醇回流取3次,濃縮液濃度為0.1 g/mL(以生藥計),洗脫劑采用95%乙醇,1 BV/h的速度洗脫,得到純化物備用。以NP-700(0.009 7)∶甘油(0.548 5)∶純水(0.347 5)∶Al(OH)3(0.011 0)∶酒石酸(0.003 5)∶薄荷腦(0.013 2)的配比,制備基質,加入13.37 g的馬蘭純化物進行配置,充分攪拌均勻,靜置30分鐘以備用[9]。

呋塞米(20 mg/片,南通制藥總廠),螺內酯(20 mg/片,杭州民生藥業集團有限公司)。

1.3 主要試劑

四氯化碳(貨號C10711535,上海麥克林);橄欖油(貨號QS310002012787,上海嘉里食品工業有限公司);水合氯醛(貨號A600288-0250)、多聚甲醛(貨號A500684)購自上海生工;白蛋白檢測試劑盒(貨號A020-1,北京雷根);PBS(貨號210220,莫納生物科技有限公司);伊紅染色液(貨號DH0055)、蘇木素染色液(貨號DH0001)購自雷根生物;山羊血清(貨號C0265)、DAPI染液(貨號C1005)、抗熒光淬滅劑(貨號P0126)、TritonX-100(貨號ST795)、Tunel染色試劑盒(C1089)購自碧云天;Bax一抗(貨號A19684,Abclonal);Bcl-2一抗(貨號ab182858,美國Abcam)。

1.4 主要儀器

BSA224S型電子分析天平(萬分之一)(瑞士Precisa12A公司);RM2235型切片機、HI1220型烤片機、HI1210型展片機(德國Leica);Thermo型微量紫外-可見光分光光度計(美國NanoDrop One/One C);4402型膠體滲透壓儀(美國WESCOR);DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械廠);SP0009-R型外科手術器械包(瑞沃德);HB-RO/60型超純水儀(美國Millipore);LMQ C-50EP型高壓蒸汽消毒滅菌鍋(浙江紹興醫療器械總廠);TCS-SP8型激光共聚焦成像系統(德國Leica);CKK53型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.5 肝硬化腹水大鼠模型建立

將60只健康SPF雄性SD大鼠隨機分為空白組(10只)和造模組(50只),適應性喂養1周,參照文獻方法[10]空白組大鼠常規飼養,造模組給予腹腔注射CCl4-橄欖油混合液(4∶6)進行造模,飲用水為10%的醫用酒精水溶液。根據體質量,除第1天注射劑量按3.0 mL/kg計算,以后每天的劑量為2.0 mL/kg,隔天1次,持續6周。隨機抓10只抽取腹水,根據成模標準[11-12]判斷是否成功復制肝硬化腹水大鼠模型。

1.6 分組及給藥

將40只造模成功的大鼠隨機分為模型組、基質組、馬蘭草凝膠貼劑組、呋塞米+螺內酯組,每組10只。空白組、模型組常規飲食飲水,脫毛抓取,將大鼠放置在大鼠固定器上,固定時間同基質組和馬蘭草凝膠貼劑組的時間。基質組給予無藥物的基質臍貼,兩天一次,每次1.5小時,干預持續8周。臍貼貼于大鼠神闕穴,位于大鼠胸腹正中線,胸骨柄上緣至外生殖器連線的上3/4及下1/4交界處[13]。馬蘭草凝膠貼劑組給予馬蘭草凝膠貼敷于臍,兩天一次,每次1.5小時,干預持續8周。呋塞米+螺內酯組以1∶1混合濃度為0.082 5 mg/mL,灌胃劑量10 mL/kg,兩天一次,干預持續8周。

1.7 取材

大鼠末次給藥后,禁食12小時,不禁水,腹腔注射10%水合氯醛,以麻醉大鼠。將大鼠仰臥固定于手術臺上,延腹中線用手術刀切開,進入腹腔,分離腹主動脈取血5 mL,靜置2小時后,4℃ 3 000 r/min離心20分鐘,分離血清,-20℃凍存待檢,保存備用。每組隨機抽取三只大鼠肝臟,在肝右葉離邊緣1 cm處,剪取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織塊,液氮保存。

1.8 指標檢測

1.8.1 大鼠一般狀態觀察 給藥期間觀察各組大鼠活動情況、精神狀態、皮毛潤澤度、飲食及大便等一般狀態改變。

1.8.2 腹水測量 給藥結束后取材時,將大鼠采用10%水合氯醛進行麻醉,剖腹,采用無菌干棉球沾取腹水稱量。

1.8.3 大鼠測量白蛋白、膠體滲透壓 剝離出腹主動脈,采集血液約5 mL,靜置1小時后,4 000 r/min離心10分鐘取血清,按照檢測試劑盒操作說明書檢測血清白蛋白、膠體滲透壓水平。

1.8.4 大鼠肝組織病理變化 剪取肝組織,浸泡在4%多聚甲醛中,常規脫蠟、包埋,做石蠟病理切片,用于蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,鏡下觀察病理切片變化,拍照。

1.8.5 Tunel-α-平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)雙標記法檢測活化HSC凋亡情況 切取肝組織5 μm置于防脫玻片上,常規石蠟切片脫蠟、復水,雙蒸水清洗2分鐘×3次。滴加一抗Anti SMA,并放置在濕盒中4℃孵育下過夜。磷酸緩沖鹽溶液洗滌3分鐘×3次。然后用不含DNase的蛋白酶K,滴加20 μg/mL,放置于37℃烤箱,留置30分鐘。磷酸緩沖鹽溶液洗滴2分鐘×3次。滴加Tunel檢測液50 μL,蓋上蓋玻片。放置于37℃烤箱,留置30分鐘,室溫避光下孵育60分鐘。磷酸緩沖鹽溶液洗滴2分鐘×3次。DAPI復染,抗熒光淬滅劑封片。放置在顯微鏡下觀察細胞凋亡情況,拍照、采集圖像。

1.8.6 免疫熒光法檢測Bax和Bcl-2 0.5% TritonX-100,磷酸緩沖鹽溶液清洗切片3分鐘×3次。封閉切片滴入正常山羊血清,室溫60分鐘,切片加一抗(1∶200,PBS稀釋),置于4攝氏度下過夜。磷酸緩沖鹽溶液重復洗滌3分鐘×3次,滴加熒光二抗488(1∶300,PBS稀釋)37攝氏度60分鐘。磷酸緩沖鹽溶液浸洗3分鐘×3次,滴加一抗(1∶200,PBS稀釋),37攝氏度60分鐘,滴加熒光二抗488(1∶300,PBS稀釋),37攝氏度60分鐘,磷酸緩沖鹽溶液浸洗3次各3分鐘。DAPI核染,放置室溫避光15分鐘(暗室內進行),再用磷酸緩沖鹽溶液重復沖洗4次各5分鐘,熒光顯微鏡下觀察各組熒光強度、拍照。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般狀態

空白組大鼠活動度大,運動靈活,精神狀態佳,皮毛光澤明潤,食欲正常,糞便成形;模型組大鼠活動緩慢,精神萎靡,皮毛澤松散,飲食不振,便溏。各治療組用藥后上述表現逐漸好轉,尤其馬蘭草凝膠貼劑組改善明顯。

2.2 大鼠腹水量比較

與空白組比,模型組大鼠腹水量明顯增加(P<0.01);與模型組比,基質組差異無統計學意義(P>0.05),馬蘭草凝膠貼劑組和呋塞米+螺內酯組的腹水量均呈明顯降低趨勢(P<0.01),尤以馬蘭草凝膠貼劑組的腹水量降低最為明顯;與基質組比,馬蘭草凝膠貼劑組、呋塞米+螺內酯組的腹水量均降低(P<0.01),尤其馬蘭草凝膠貼劑組的腹水量降低最為顯著。見表1。

表1 各組肝硬化腹水模型大鼠腹水量比較

2.3 大鼠血清白蛋白、血漿膠體滲透壓水平比較

與空白組比,模型組血清白蛋白、血漿膠體滲透壓水平均明顯降低(P<0.01);與模型組相比,基質組血清白蛋白水平下降(P<0.05),血漿膠體滲透壓水平降低,但無統計學意義(P>0.05),馬蘭草凝膠貼劑組和呋塞米+螺內酯組血清白蛋白、血漿膠體滲透壓水平均明顯升高(P<0.01),尤以馬蘭草凝膠貼劑組升高水平最為明顯;與基質組比,馬蘭草凝膠貼劑組、呋塞米+螺內酯組血清白蛋白、血漿膠體滲透壓水平均明顯升高(P<0.01),尤其蘭草凝膠貼劑組升高最為顯著。見表2。

表2 各組肝硬化腹水模型大鼠血清白蛋白、血漿膠體滲透壓比較

2.4 大鼠肝組織病理學觀察

空白組的肝小葉結構完整、清晰,細胞形態正常,肝血竇未見擴張。模型組肝小葉結構被破壞,假小葉形成,肝細胞出現壞死,炎性細胞浸潤,纖維增生明顯。基質組可見少量纖維增生,門管區少量炎性細胞浸潤。馬蘭草凝膠貼劑組肝細胞結構接近正常,細胞大小均勻,門管區炎性細胞浸潤顯著減輕。呋塞米+螺內酯組肝細胞結構、形態恢復近正常,假小葉未見形成。見圖1。

注A 空白組;B 模型組;C 基質組;D 馬蘭草凝膠貼劑組;E 呋塞米+螺內酯組。圖1 各組肝硬化腹水模型大鼠肝組織病理切片(HE染色,×200)

2.5 大鼠肝組織活化HSC凋亡情況

圖中綠色熒光代表活化HSC表達的α-SMA陽性細胞,紅色熒光代表凋亡的Tunel陽性細胞,Merge圖中玫紅色代表活化的HSC凋亡。結果顯示,與空白組比,模型組有少數不明顯的Tunel陽性細胞,有許多明顯的α-SMA陽性細胞;與模型組比,基質組的α-SMA陽性細胞明顯增多,熒光明顯增強,Tunel陽性細胞明顯增多,馬蘭草凝膠貼劑組和呋塞米+螺內酯組的α-SMA陽性細胞明顯減少,Tunel陽性細胞明顯增多,熒光明顯增強。與基質組比,馬蘭草凝膠貼劑組和呋塞米+螺內酯組的α-SMA陽性細胞明顯減少,熒光減弱,Tunel陽性細胞增多;與馬蘭草凝膠貼劑組比,呋塞米+螺內酯組中α-SMA陽性細胞明顯增多,熒光明顯增強,Tunel陽性細胞增多,表明馬蘭草凝膠貼劑更能抑制細胞活化,促進活化HSCs凋亡。見圖2。

圖2 各組肝硬化腹水模型大鼠肝組織活化HSC凋亡情況(Tunel-α-SMA法,×200)

2.6 大鼠肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達情況

與空白組比較,模型組Bcl-2、Bax表達量顯著升高,熒光顯著增強;與模型組比較,基質組Bcl-2、Bax表達量均降低,熒光減弱,馬蘭草凝膠貼劑組和呋塞米+螺內酯組的Bcl-2表達量降低,熒光減弱,Bax表達量明顯升高;與基質組比,馬蘭草凝膠貼劑組、呋塞米+螺內酯組Bcl-2表達量降低,熒光減弱,Bax表達量明顯升高,其中馬蘭草凝膠貼劑組Bax表達量升高最為顯著。見圖3。

3 討論

肝硬化是受一種或者多種因素(病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎)的反復影響而發展而來的慢性、進行性肝病,預后不良,并發癥多,其中腹水是肝硬化晚期進入失代償期的典型并發癥之一。目前認為門脈高壓是肝硬化腹水發病機制的始動因素[14],活化的HSCs在門脈高壓中占據主導作用[15],故誘導活化的HSCs凋亡是治療肝硬化腹水的有效策略。HSCs位于Disse腔中,呈梭形、多邊形,形態不規則。肝臟未受炎癥物質及外界刺激時,HSCs處于靜止的狀態,不表達α-SMA,當肝臟被刺激時,靜態的HSCs被激活,高表達α-SMA,使HSCs收縮力增強,肝內壓力變大,靜脈壓力增高[16]。本研究結果顯示,馬蘭草凝膠貼劑組的α-SMA陽性細胞結果表達明顯減少,熒光減弱,Tunel陽性細胞增多,提示馬蘭草凝膠貼干預能有效地引起活化的HSCs產生凋亡,對肝硬腹水大鼠治療有效。

Bcl-2家族由促凋亡(或細胞死亡)和抗凋亡(或細胞存活)基因組成,正是這些基因譜系之間的表達平衡決定了細胞的死亡或存活,Bcl-2家族分子分為Bcl-2(抗凋亡蛋白)、Bax(促凋亡蛋白)[17-18]。促凋亡、抗凋亡與Bax/Bcl-2比值密切聯系,Bax蛋白表達量升高,Bcl-2蛋白表達量降低,比值升高,可促進細胞凋亡,反之起抑制細胞凋亡作用。有研究表明[19],在新型孕烯醇酮衍生物通過Bcl-2家族基因調控肝癌細胞凋亡的體外研究中發現,通過提高Bax/Bcl-2比值,能誘導細胞凋亡。本研究發現馬蘭草凝膠貼劑組能顯著升高Bax表達,降低Bcl-2表達,表明馬蘭草凝膠貼能有效促進活化HSCs產生凋亡,改善肝硬化腹水。

肝硬化腹水屬于中醫學“積聚”“鼓脹”“脅痛”“黃疸”的范疇,主要病因有飲食不節、七情、過度勞欲等,病機與肝、脾、腎三臟功能失調密切相關,表現為肝失疏泄,脾失健運,腎失開闔,致氣、血、瘀、水積于腹中[20]。本病的治療應采用疏肝理氣、健脾助運,溫腎陽以開闔的治療原則,達行氣活血、散瘀消腫的功效。

中醫貼敷臍療法發揮藥、穴位、經絡聯合作用,可起到疏通全身氣血、溫通經脈、活絡散瘀的功效。貼敷臍療法又被稱作“臍療法”,將藥物于貼敷神闕穴處,神闕穴與五臟、六腑、全身經絡密切聯系,主司百脈[21]。且在胚胎發育過程當中,臍作為腹壁的最后的閉合之處,該處無脂肪組織,角質層菲薄,是多條經脈循行之地,有眾多靜脈網和動脈分支經過,因此使其具備吸收力強、迅速,生物利用度高的特點,藥物通過臍快速疏布至全身[22]。

患有腹水的患者免疫力都大幅度減低,從細胞水平上進行剖析,通過刺激神闕穴,能起到激活機體免疫系統、提高免疫功能作用[23]。馬蘭草為菊科馬蘭的全草,是一種藥食同源的植物,具有豐富的營養價值,化學成分主要包括萜、有機酸、糖苷、酚類等化合物,藥理效應有保肝、抗氧化、抗腫瘤、抗炎[24]。有研究顯示[25],馬蘭草治療肝病療效確切,具有一定的預防和治療作用。課題組前期研究發現馬蘭草臍灸能改善肝硬化腹水大鼠的一般狀態,消退腹水。本研究結果顯示,馬蘭草凝膠貼劑可改善大鼠一般狀態,顯著降低大鼠腹水量,升高血清白蛋白、血漿膠體滲透壓水平,病理檢測見微量炎性細胞、細胞變性減少、細胞大小均勻,提示馬蘭草凝膠貼劑能有效促進腹水的消退,緩解腹脹,增加肝臟的供血量,修復肝組織病理形態,減輕肝細胞損傷。

綜上所述,馬蘭草凝膠貼劑能有效治療肝硬化腹水大鼠,其作用可能機制與修復肝組織病理形態和促進活化的HSCs凋亡有關。