NLRP3炎癥小體對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9C2鈣化的影響

阮浩航，王 煒，王 洪，曾圣強(qiáng)，沈思蘭

[江西省人民醫(yī)院（南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院） 心內(nèi)科，330006 ]

心血管疾病是世界范圍內(nèi)最常見的致死性疾病，包括心肌鈣化、心肌炎癥等在內(nèi)的多種心血管病變，嚴(yán)重危害人類健康[1]。已有研究表明[2]，心肌鈣化情況不僅好發(fā)于成人，而且在嬰幼兒時(shí)期也會(huì)出現(xiàn)心肌鈣化情況，但目前對(duì)于具體的導(dǎo)致心肌鈣化的分子機(jī)制，臨床尚無可靠報(bào)道。作為機(jī)體免疫的固有成分，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體，參與調(diào)控多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。Gao等[3]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950在心肌梗死小鼠模型中可以減少心肌纖維化并改善心臟重構(gòu)情況；Yao等[4]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)心肌細(xì)胞中NLRP3炎癥小體通路可以促進(jìn)小鼠房顫模型的發(fā)生發(fā)展；Busch等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠膿毒癥心肌病模型中，抑制NLRP3/白介素-1β（IL-1β）可以減輕膿毒癥心肌病引起的心肌萎縮。但目前關(guān)于NLRP3炎癥小體對(duì)心肌細(xì)胞鈣化的影響情況尚不明確。因此本研究采用β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鈣化模型，在細(xì)胞水平觀察NLRP3炎癥小體抑制劑NLRP3-IN-2對(duì)心肌細(xì)胞鈣化損傷的影響；同時(shí)在基因水平觀察凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、胱天蛋白酶1（caspase-1）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2） mRNA的表達(dá)變化，探討NLRP3-IN-2是否通過調(diào)控NLRP3/ASC/Caspase-1信號(hào)通路來抑制心肌細(xì)胞鈣化，為心肌鈣化的預(yù)防和治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器大鼠心肌細(xì)胞H9C2購自武漢普諾賽生命科技有限公司；β-甘油磷酸鈉（Solarbio，貨號(hào)：G8100）；NLRP3-IN-2（MCE，貨號(hào)：HY-W011082）；Von Kossa染色試劑盒（索萊寶，貨號(hào)：Cat#G3282）；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（南京建成，貨號(hào)：A059-2-2）；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（MULTI SCIENCES 聯(lián)科生物，貨號(hào)：AP101-100-kit）。全自動(dòng)酶標(biāo)儀（北京六一生物科技有限公司，貨號(hào)：WD-2012B）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司，貨號(hào)：DHP-9082B）；NovoCyte?流式細(xì)胞儀（艾森生物有限公司，貨號(hào)：NovoCyte 2060R）；全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，貨號(hào)：Tiss-12）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，貨號(hào)：H1750R）；熒光PCR儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，貨號(hào)：CFX Connect?實(shí)時(shí)）。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，用1×PBS洗兩遍，加入0.25%胰酶[含0.02% 乙二胺四乙酸（EDTA）]消化，待細(xì)胞變圓加入培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞懸液至10 mL離心管中，以1 000 r/min離心3 min，棄去上清液加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；將細(xì)胞懸液按照1∶2的比例分配至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 心肌細(xì)胞鈣化模型及分組采用10 mM的β-甘油磷酸鈉培養(yǎng)10 d，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鈣化模型。具體分組為：空白對(duì)照組、心肌細(xì)胞鈣化模型組、模型+NLRP3抑制劑組。空白對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理；模型+NLRP3抑制劑組為造模前采用10 μM NLRP3-IN-2預(yù)處理細(xì)胞，并于24 h后再采用β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK8）檢測(cè)細(xì)胞貼壁后，加入相應(yīng)的藥物處理一定時(shí)間后將待測(cè)的96孔板細(xì)胞換成相同的培養(yǎng)基，每孔100 μL；每孔加入10 μL CCK8試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h；酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測(cè)每孔的吸光值。

1.5 Von Kossa染色去除培養(yǎng)基，用蒸餾水清洗1～2次，2～3次/min；之后每孔加入適量的Von Kossa銀溶液，強(qiáng)光照射15～60 min；蒸餾水清洗細(xì)胞1～2次，2～3次/min；入海波溶液處理2 min；HE染色液復(fù)染細(xì)胞核；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，于顯微鏡下拍照觀察。

1.6 堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的ALP活性采用生化試劑盒檢測(cè)，參照堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集1×106個(gè)細(xì)胞，加1 mL PBS，以1 500 r/min 離心3 min，洗兩遍。用雙蒸水將5×Binding Buffer 稀釋為1×Binding Buffer。取300 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞。每管各加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，輕微混勻后，室溫避光孵育10 min 。再向每管中加入200 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer。混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)（qPCR）收集樣本，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。ASC引物為5’-GGCACAGCCAGAACAGAACA-3’，5’- GGTCTGTCACCAAGTAGGGC-3’。caspase-1引物為5’- AAACGCCATGGCTGACAAGA-3’，5’- ACATGATCGCACAGGTCTCG-3’。BMP-2引物為5’-GTCCCTCGGACAGAGCTTTT-3’，5’-CACCATGGTCGACCTTTAGGA-3’。Runx2引物為5’- TCTGCCGAGCTACGAAATGC-3’，5’-TGAAACTCTTGCCTCGTCCG -3’。β-actin引物為5’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’，5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。反應(yīng)步驟如下：預(yù)變性95 ℃，10 min；變性95 ℃，10 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。β-actin作為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，定量結(jié)果采用（±s)）表示。兩組之間定量數(shù)值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物濃度摸索由下圖1可知，與空白組相比，10 mM、15 mM、20 mM的β甘油磷酸鈉細(xì)胞增殖顯著下降（P＜0.05）。根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]中造細(xì)胞鈣化模型的藥物濃度，本研究選擇10mM的β甘油磷酸鈉進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與空白對(duì)照組相比，10 μM的NLRP3-IN-2組細(xì)胞增殖顯著增加（P＜0.05），而60 μM和80 μM組細(xì)胞增殖顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），因此選擇10 mM的NLRP3-IN-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 CCK8法摸索β甘油磷酸鈉和NLRP3-IN-2的藥物作用濃度

圖2 Von kossa染色觀察各組細(xì)胞鈣化情況

2.2 Von kossa染色觀察各組細(xì)胞鈣化情況由圖2可知，空白對(duì)照組未見黑色顆粒鈣質(zhì)沉積；模型組可見明顯的深褐色和深黑色顆粒鈣質(zhì)沉積，部分細(xì)胞纖維紊亂、斷裂；模型+NLRP3-IN-2組可見少量的黑色顆粒鈣質(zhì)沉積，細(xì)胞鈣化情況有所緩解。

2.3 流式檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況由下圖3可知，與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，模型+NLRP3-IN-2組細(xì)胞凋亡顯著下降（P＜0.05）。

圖3 流式檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

2.4 NLRP3-IN-2對(duì)心肌細(xì)胞鈣化模型中ALP活性、ASC、caspase-1、BMP-2、Runx2 mRNA表達(dá)水平的影響如下圖4A所示，與空白對(duì)照組相比，模型組中ALP活性水平顯著上升（P＜0.05）；而與模型組相比，模型+NLRP3-IN-2組的ALP活性水平顯著下降（P＜0.05）。如下圖4B所示，與空白對(duì)照組相比，模型組中ASC、caspase-1、BMP-2、Runx2 mRNA表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，模型+NLRP3-IN-2組中ASC、caspase-1、BMP-2、Runx2 mRNA表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。

圖4 NLRP3-IN-2對(duì)心肌細(xì)胞鈣化模型的影響

3 討論

心肌鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓等多種疾病的危險(xiǎn)因素[8-9]。近年來已有研究認(rèn)為，心肌鈣化主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程，該過程受多種信號(hào)通路的調(diào)控[10-11]。在本研究中，10 mM的β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)心肌細(xì)胞10 d可以復(fù)制心肌細(xì)胞鈣化模型，采用NLRP3抑制劑NLRP3-IN-2預(yù)處理細(xì)胞后可以有效地緩解黑色顆粒鈣質(zhì)沉積情況，減輕心肌細(xì)胞凋亡，下調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)ALP水平的活性，下調(diào)ASC、caspase-1、BMP-2、Runx2 mRNA表達(dá)水平。

NLRP3炎癥小體是一種大分子多蛋白復(fù)合體，主要由NLRP3蛋白與ASC和胱天蛋白酶原1（pro-caspase-1）組裝而成，多種病原和損傷相關(guān)的分子模式均可對(duì)其進(jìn)行活化，對(duì)機(jī)體內(nèi)固有免疫系統(tǒng)發(fā)揮的免疫作用具有一定的調(diào)控作用[12]。目前已有相關(guān)研究表明，NLRP3炎癥小體參與調(diào)控血管鈣化的發(fā)生發(fā)展[13]。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，氧化三甲胺（TMAO）可以通過激活NLRP3炎癥小體和核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）信號(hào)軸促進(jìn)血管鈣化的進(jìn)程；Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可以通過靶向NLRP3信號(hào)軸，抑制大鼠的血管鈣化情況。但目前尚無研究報(bào)道NLRP3炎癥小體如何調(diào)控心肌鈣化的分子機(jī)制。

堿性磷酸酶是廣泛存在于機(jī)體的血管中，其是鈣鹽形成過程中的關(guān)鍵酶[16]。已有研究表明，ALP在血管鈣化過程中可以起到重要的調(diào)控作用[17]。在生物鈣化過程中，ALP可通過水解各種磷酸酯鍵增加機(jī)體中的磷酸鹽濃度，在磷酸鈣結(jié)晶的過程中，起到生成原料的作用；此外， ALP 還可通過使焦磷酸鹽被其水解，然后促進(jìn)磷酸鈣的生成。楊英等[18]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠血管鈣化模型中其ALP活性顯著升高，該結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

Runx2是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以參與調(diào)控機(jī)體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的進(jìn)程。胡曉青等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨分化過程中，Runx2的表達(dá)上調(diào)；楊鋒等[20]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎填精法可以通過上調(diào)Runx2蛋白的表達(dá)促進(jìn)BMSCs的成骨分化。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLRP3-IN-2可以下調(diào)Runx2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善心肌細(xì)胞的鈣化情況，該結(jié)果符合Runx2的促進(jìn)成骨的轉(zhuǎn)錄功能。BMP-2是多肽生長因子，在體內(nèi)同樣具有誘導(dǎo)細(xì)胞成骨樣表型轉(zhuǎn)變的功能。賴文濤等[21]研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2過表達(dá)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)其成骨功能，并加重其鈣鹽沉積的情況。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLRP3-IN-2可以下調(diào)BMP-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善心肌細(xì)胞的鈣化情況，該結(jié)果符合BMP-2的促進(jìn)成骨及鈣化的功能。

綜上所述，本研究明確了NLRP3炎癥小體抑制劑NLRP3-IN-2對(duì)心肌細(xì)胞鈣化的抑制作用，該作用可能是通過抑制ASC/Caspase1通路的活化，抑制Runx2、BMP-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，但其緩解鈣化的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。