苯丙氨酸脫氫酶分離純化的開放實驗教學設計與實踐

李進軍 趙 晨 王輅 李端華

關鍵詞：苯丙氨酸脫氫酶；純化；開放實驗；教學設計與實踐

苯丙氨酸脫氫酶（Phenylalanine Dehydrogenase，PheDH）可以催化苯丙氨酸轉化為苯丙酮酸。苯丙氨酸脫氫酶異常會導致苯丙氨酸代謝紊亂，進而引發苯丙酮尿癥等疾病。苯丙氨酸脫氫酶在醫學和生物技術領域有著廣泛的應用，如苯丙酮尿癥的診斷、治療和預防[1]以及高價值氨基酸和藥物類多肽等的合成[2]。

苯丙氨酸脫氫酶是本課題組研究較為深入的酶類。其中，李進軍等[3]用雙水相方法純化苯丙氨酸脫氫酶，提供了一種簡便、有效、綠色的純化策略，收率和純度都達到了較高水平；夏羽行等[4]在雙水相純化的基礎上用離子純化得到高純度酶，并研究了酶學性質相關內容。

在生源方面，成都大學藥學院本科生生源較好，錄取分數在重本以上，有較好的學習能力且有極大可能繼續升學研究，即使是本科畢業直接工作，也有必要開設開放實驗課程，不僅能培養學生的大局觀，使其了解本科所學知識在一個項目層級中扮演的角色，還能讓學生在找工作時提前錨定自己的興趣點，避免盲目選擇。

本開放實驗的特點在于脫胎于整個實際項目并合理簡化，以實現本科層次的教學目的，旨在培養學生的項目觀念，為學生完成畢業設計、本科畢業后工作以及繼續深造奠定基礎。

1 實驗設計

1.1 實驗目的

了解整個項目的內容和流程，熟悉搖床發酵、超聲破壁、雙水相提取、手動裝柱和純化、高效液相色譜（HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC）分析和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析等實驗操作步驟，系統訓練學生搜尋文獻、設計實驗內容、分析實驗數據、撰寫報告等方面的能力。

1.2 課程安排

課程具體安排如表1所示，課程設計按照內容邏輯安排，實操時可根據實際情況拆分。

1.3 儀器與試劑

高效液相色譜儀（E2695型，Waters公司；LC-2010A，日本島津公司）；微孔板分光光度計（Epoch，Biotek公司）；電泳儀（Bio-Rad公司）；超聲破碎儀（JYD-650L，上海之信儀器公司）；半制備液相色譜系統（日本島津公司）；多通道蠕動泵（保定雷弗）；冷凍離心機（J-26XP，美國BECKMAN公司）；數顯恒溫振蕩器（SHA-B，常州澳華儀器公司）；制冰機（IMS-20，常熟市雪科電器有限公司）。

酵母浸粉、胰蛋白胨（OXOID公司）；IPTG、Bradford試劑及氨芐西林（生工生物工程公司）；苯丙氨酸；PEG 4000、硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化鈉、EDTA、β-巰基乙醇（科龍化學試劑公司）；NAD+、NADH（Amersco公司）；Q-FFSepharose（GE公司）；色譜甲醇、色譜乙腈（Swell）；其他化學試劑均為分析純，水為去離子水。

2 課程實踐

2.1 文獻查閱及方案設計

（1）指導學生使用學校數據庫，并鼓勵學生通過校外途徑獲取更多文獻資源；（2）培養學生提取關鍵詞的能力，如本實驗中的“苯丙氨酸脫氫酶”“離子柱純化”“雙水相萃取”以及“柱效測定”等；（3）教會學生高級檢索、檢索結果排序、在結果中進一步檢索等手段；（4）教會學生選定特定來源的文獻，如特定機構、高校、院所發表的文獻，或被北大核心期刊庫、SCI等收錄的文獻；（5）教會學生追蹤并細化檢索該領域的活躍單位及個人。

讓學生了解如何尋找各類具體技術的參考源，如相關工具書、搜索引擎、學術博客、專利、儀器耗材廠家技術支持等。

學生閱讀、總結文獻后，結合本課題研究內容，以小組為單位設計實驗方案，內容包括材料、儀器、方法等，教師批閱后再次修改，最終形成完整的實驗方案，指導教師對小組方案作出分析和評價。

2.2 種子培養，誘導搖瓶培養

實驗前，教師需要講解的內容有：（1）菌種來源，重點是用于轉化株的篩選、不容易染菌等抗性基因的作用以及菌種庫的建立和使用；（2）超凈臺操作規范，重點講解接種的操作要領；（3）搖床發酵，重點講解溶解氧、剪切力等與轉速和擺放位置的關系；（4）產物誘導，重點講解異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside，IPTG）誘導原理以及溫度的影響；（5）大型離心機的使用，重點闡述配平規則，強調安全事項。

實驗內容：（1）取出甘油管凍存的菌種，解凍后接種至種子培養基過夜培養；（2）過夜種子接種于裝有發酵培養基的滅菌搖瓶中，培養至特定菌體濃度后，加入IPTG誘導20 h；（3）離心，將菌體沉淀置于﹣20 ℃冰箱中保存備用。

2.3 樣品提取，樣品粗純

樣品提取和粗純是純化工作中的重要步驟，決定了實際可得產量，并嚴重影響后續純化策略的實施。

實驗前教師需要講述的內容有：（1）胞內表達和胞外表達、可溶表達和包涵體表達的區別；（2）破壁方式，重點講述化學破壁、物理破壁以及超聲破碎儀的使用方法；（3）雙水相原理，重點講述分相原理和霍夫梅斯特序列（Hofmeister series）。

實驗內容：（1）將菌體解凍，用緩沖液重懸；（2）在冰浴條件下超聲破碎，離心后得到澄清的粗酶液以備純化；（3）將上清酶液加入配制好的雙水相體系中，振蕩后低速離心，將萃取層置于﹣20 ℃下以備后續純化。

2.4 色譜柱裝填，測定柱效

色譜柱作為液相分析的核心，對分離分析有重要影響，而色譜柱的效果主要由填料和裝填技術決定，尤其是前者，其發展和革新貫穿于整個液相分析技術的發展歷程并起到決定性作用。手動裝填色譜柱能讓學生更加深刻地理解液相層析柱的原理和本質，故采用手動裝填色譜柱的方式。

實驗前需要復習和講述的內容有：（1）色譜學的平衡理論、塔板理論以及最重要的速率理論，因為其不僅提出了范第姆特方程式，還引入了柱效、分離度等重要概念；（2）作為液相系統的核心，色譜柱的構造和組成包括柱體、填料、密封環；（3）作為色譜柱的核心，填料的基質主要分為硅膠、多糖基軟膠（瓊脂糖和葡聚糖）、聚合物硬膠（聚苯乙烯和聚苯烯酸酯）。通過化學法偶聯各種基團（如磷酸基、季銨基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體，衍生出種類繁多的色譜柱類型，如正向色譜柱、反相色譜柱、親水色譜柱、疏水色譜柱、離子交換色譜柱、親和層析色譜柱、體積排阻色譜柱等，為多種多樣的化合物分離提供可能。

實驗內容：（1）每組分發100 mL QFF離子交換樹脂，每人分發一根10 mL Flash空柱，在教師的指導下裝填；（2）將色譜柱接至蠕動泵，以20%乙醇為流動相，流速漸增到5 mL/min，維持10 min以壓緊填料；（3）手動裝柱經驗性較強，個人差異大，故所裝填色譜柱需要進一步測定柱效，評價裝柱質量和水平，柱效通常用理論塔板高度（Height Equivalent of Theoretical Plate，HETP）和非對稱因子（Asymmetric Factor，As）來評價。

2.5 離子柱精純，酶活分析

親手搭建簡易多通道色譜系統能讓學生更深刻地領悟色譜系統的組成及作用。采用多泵頭蠕動泵作為液體傳輸系統能同時操作多個色譜柱層析，大大降低設備成本和時間成本。采用手動裝填色譜柱為層析柱，按照傳統的梯度洗脫和分步收集方式純化和收集樣品。蛋白濃度和酶活的分析均采用超微量微孔板分光光度計來實現，都要建立標準曲線，好處是可單次檢測多個樣品，且耗時短、消耗試劑少。蛋白濃度測定采用Bradford方法（BSA為標準蛋白），酶活檢測依據NADH在340 nm的減少量來計算，定義每分鐘消耗1 mol/L NADH的酶量為1個酶活單位（U）[5]。

實驗前，教師應講述的內容有：（1）簡易色譜系統的搭建。雖然是簡易色譜系統，但仍舊包含輸液系統、進樣系統、分離系統、收集系統、檢測系統；（2）梯度洗脫方式和分布收集方式的具體操作方法；（3）超微量微孔板分光光度計的使用步驟；（4）蛋白濃度和酶活檢測原理以及比活性（酶活力/蛋白濃度）和純化倍數（純化后酶比活性/純化前酶比活性）等相關重要參數。

實驗內容：（1）連接色譜柱和蠕動泵，準備好流動相和接樣瓶；（2）用平衡液平衡色譜柱；（3）采用泵吸入方法上樣；（4）鹽濃度梯度洗脫，分步收集；（5）檢測各梯度洗脫液的蛋白含量；（6）檢測各梯度洗脫液的酶活；（7）選擇酶活最高的組分，凍存后以備后續分析。

2.6 HPLC分析，SDS-PAGE分析

在進行高效液相分析前，教師應參照前面搭建的液相系統對比講解，讓學生更深入地了解液相色譜的構造、原理及作用，楊衛靈等[6]基于HPLC測定氨基酸的開放實驗很有參考價值。

HPLC分析實驗內容：（1）樣品前處理，參照2.3提取并粗純樣品，強調前處理的重要性，若操作不當，會造成樣品失真、樣品污染、色譜柱堵塞等；（2）液相方法的編輯，包括洗脫梯度、溫度、最高壓力、最低壓力及檢測波長等參數的設定；（3）樣品序列編輯，用批處理來說明高效液相色譜對人力的解放和生產力的提高作用；（4）數據批量處理，包括數據處理方法的設置、結果和報告的批量導出。

在SDS-PAGE操作前，講解SDS-PAGE的基本原理：

（1）說明β-巰基乙醇、SDS、溴酚藍（BPB）等試劑的作用；

（2）重點闡述濃縮膠、分離膠的制備及所起作用和原理。

SDS-PAGE分析實驗內容：（1）樣品前處理，根據目的選擇還原或非還原Loading Buffer。根據樣品性質選擇沸水浴、溫水浴或者直接上樣，同時要注意樣品是否含有高濃度鹽或Triton等能產生嚴重干擾的化學物質。（2）上樣、電泳。根據樣品濃度合理稀釋，樣品量過多、過少均會影響跑膠效果；小心加樣，既不能破壞加樣孔，也不能使樣品溢出加樣孔；設定好既定程序開始電泳。（3）染色、脫色。等待示蹤染料溴酚藍跑至膠末端，同時關注Marker情況，結束后關閉電源，去除濃縮膠后將分離膠染色40 min，再脫色1 h，并換脫色液2～3次。（4）用Image Lab分析主條帶純度[7]。

2.7 數據處理

收集并整理各步驟相關數據，推薦使用Excel編排，學會剔除異常數據，采用函數公式計算均值、方差、標準差和相對標準偏差；學會繪制標準曲線圖，得出線性公式；學會繪制散點圖、柱狀圖、雙Y軸圖。

2.8 報告撰寫

以小組為單位，嚴格依據模版格式撰寫報告，按國標GB/T 15834—2011規范使用標點符號，表頭、圖注的格式保持全文統一，做到數據真實、內容完整、行文流暢、邏輯清晰。根據數據討論結果產生的原因，并對后續實驗改進提出建議。最后總結該開放實驗教學課程，寫出自己的進步、感悟和所得。

3 結語

通過開放實驗教學，學生不僅能了解發酵、提取、粗純、精純、分析整條鏈的內容，使本科教學知識點融為一體，還能通過文獻調研、數據分析和報告撰寫進一步提升科研水平，對本科畢業設計、就業和升學深造都大有裨益。