重組腺相關病毒基因藥物臨床前評價方法的回顧與展望

李佳莘 黎玲 黃藝峰 刁勇

摘要：

重組腺相關病毒（rAAV）基因藥物在臨床應用過程中長期療效不確定，甚至存在安全性風險，是制約其廣泛應用的主要障礙.對現有rAAV基因藥物臨床前評價方法進行分析和梳理.結果表明：僅進行藥效學評價不能揭示rAAV轉導的細胞和分子機制，而基于轉導過程分析的物理轉導與功能轉導評價存在結果不一致，不能反映rAAV轉導的細胞異質性和靶細胞的空間分布特征等問題，難以準確預測rAAV基因藥物的臨床療效和安全性，需要從單分子、單細胞水平開展rAAV載體胞內命運評價的新方法，以切實保障新型rAAV基因藥物的臨床有效性和安全性.

關鍵詞： 基因治療； 臨床前評價； 胞內命運； 重組腺相關病毒

中圖分類號： R 394文獻標志碼： A ??文章編號： 1000-5013（2023）04-0421-06

Assessment and Prospects of Preclinical Evaluation Methods of Recombinant Adeno-Associated Virus Gene Medicine

LI Jiashen1， LI Ling1， HUANG Yifeng2， DIAO Yong1

（1. School of Medicine， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China；

2. Haixia Hospital Affiliated to Huaqiao University， Quanzhou 362000， China）

Abstract： Long-term efficacy uncertainty and safety risks of recombinant adeno-associated virus （rAAV） gene medicine in clinical application are the main obstacles restricting their wide applications. The current preclinical evaluation methods for rAAV gene medicine are analyzed and carded. The results show that pharmacodynamic evaluation alone cannot reveal the cellular and molecular mechanisms of rAAV transduction， while physical and functional transduction evaluations based on transduction process analysis have inconsistent results and cannot reveal the cellular heterogeneity and spatial distribution characteristics of target cell of rAAV transduction， making it difficult to accurately predict the clinical efficacy and safety of rAAV gene medicine. It is necessary to construct a new method for evaluating intracellular fate of rAAV vectors at single-molecule and single-cell level to effectively ensure the clinical efficacy and safety of novel rAAV gene medicine.

Keywords： gene therapy； preclinical evaluation； intracellular fate； recombinant adeno-associated virus

基因藥物是在基因水平進行疾病的預防或治療的藥物.基因藥物需要采用適當的基因遞送載體，將靶基因導入特定細胞內，以糾正因基因缺陷和異常引起的疾病［1］，理論上具有“一次治療、終身治愈”的優勢，已經成為生物醫藥領域研發的熱點［2-3］.自歐盟和美國食品藥品管理局（FDA）相繼批準6種以重組腺相關病毒（rAAV）為載體的基因藥物以來，rAAV基因藥物在飽受挫折后，終于進入高速發展的新時代［4］.特別是用于治療脊髓性肌萎縮癥的Zolgensma，單次應用就可將患兒的2歲存活率從8%提高到100%［5］，標志著rAAV基因藥物的療效實現了革命性突破.FDA預測，自2025年起，每年將有10～20項基因藥物被批準上市，基因藥物的全球市場規模將從2017年的10億美元增長到2024年的440億美元.在如此樂觀的市場預期刺激下，輝瑞、諾華、強生等世界制藥巨頭紛紛布局基因治療.我國也加強了rAAV基因藥物的研發，迄今已有21項rAAV基因藥物申請臨床研究，3項進入三期臨床.

然而，維持rAAV基因藥物的長期療效，避免毒副反應，仍然是困擾該領域研究人員的最大難題［6］.對治療先天性黑朦病的Luxturna的長期隨訪發現，患者視覺功能在治療后1～3年達到峰值，之后有所下降，一些受試者甚至回到了治療前狀態［7］.在歐洲獲得附條件上市批準的A型血友病基因藥物Roctavian遲遲沒有得到FDA批準，很大的原因在于其長期臨床療效仍存在不確定性［8］.雖然rAAV被公認為是最安全的基因治療載體，但近年來接連發生的由rAAV基因藥物引起的患者死亡事件［9-10］，再次敲響了用藥安全的警鐘.臨床研究表明，目前應用于基因治療的所有rAAV載體均存在不同程度的安全性和有效性缺陷.而現有的rAAV載體臨床前評價體系尚不能準確預估其臨床有效性和安全性.因此，迫切需要創建一種新型臨床前評價體系，以精準評估rAAV載體的臨床表現.因此，本文對現有rAAV臨床前評價體系的優缺點進行評價，并就未來評價體系的建立提出建議和展望.

1 rAAV基因藥物的結構及轉導過程

rAAV基因藥物的結構（圖1）非常簡單，其外部為由60個腺相關病毒（AAV）衣殼蛋白形成的病毒衣殼，內部則是可表達目的基因的rAAV基因組.在rAAV基因組中，兩端長度為145堿基的反向末端重復序列（ITR）是唯一來自野生AAV基因組的序列，其余部分都是與轉基因表達相關的序列，如啟動子和polyA（pA）尾，有時還含有基因表達調控序列等.

rAAV基因藥物的結構元件，無論是衣殼還是基因組，都會影響其藥效和毒性.在臨床研究之前，一般是利用特定的細胞和動物模型，對候選載體進行臨床前評價，即藥效學評價.rAAV基因藥物臨床前評價體系，如圖2所示.臨床研究表明，在用藥劑量相當的情況下，目前所有rAAV載體在人體內的轉基因表達水平都遠遠低于臨床前研究結果［11］.然而，為增加療效而提高用藥劑量又會引起嚴重的免疫毒性反應［12］.現有臨床前評價體系尚不能準確評估rAAV載體的臨床行為.

rAAV基因藥物的藥效依賴于載體的高效轉導.rAAV載體的轉導是一個多步驟共同參與的過程，除入胞外，還包括胞質轉運、入核、DNA雙鏈轉化、轉錄、翻譯等.Westhaus等［13］首先以“物理轉導”的概念描述rAAV載體的入胞、胞質轉運及入核等步驟，采用其攜帶的基因組DNA進行表征，而以“功能轉導”描述其轉錄、翻譯等過程，并采用其表達的mRNA和蛋白進行表征.

2 通過解析轉導過程進行rAAV載體的臨床前評價

rAAV載體轉導的第一步是與靶細胞膜上特定受體結合后入胞.學界一直將rAAV載體的入胞作為限制其轉導效率及細胞靶向的決定性因素，大量的研究集中在AAV衣殼結構的改造［6］，以提高其轉導效率或改變其轉導的組織（細胞）專屬性.

早在2007年，Wang等［14］就發現rAAV載體的入胞效率并不低，關鍵在于入胞后載體基因組的雙鏈轉化及雙鏈DNA（dsDNA）的胞內穩定性.與野生型AAV一樣，常規rAAV載體包裝的基因組也是單鏈DNA（ssDNA），必須在細胞核內經歷雙鏈轉化才具備轉錄活性.在細胞核內脫去AAV衣殼的游離ssDNA非常不穩定，必須迅速形成dsDNA.線性的dsDNA穩定性仍然較差，只可以作為轉基因瞬時表達的模板.如果要持久表達轉基因，還需要形成可抵御核酸酶降解的環狀dsDNA結構.Lang等［15］研究發現，rAAV載體以很低的劑量靜注給藥后，就可以進入幾乎所有小鼠肝臟細胞，傳統的細胞和動物評價方法遠遠低估了rAAV載體的入胞效率.

2.1 基于物理轉導的評價方法

基于物理轉導的評價方法的指導思想如下：高效的物理轉導是rAAV載體實現轉基因表達的前提，在多種載體共同參與的競爭條件下，對特定細胞物理轉導效率最高的為最佳靶向載體.Cre是一種位點特異性的DNA重組酶，能特異識別基因組中的LoxP位點，介導LoxP位點間的序列重組或刪除.基于Cre重組的AAV靶向進化（CREATE）平臺就是基于Cre-LoxP重組技術的rAAV載體評價體系［16］（圖2），采用Cre轉基因小鼠直接進行體內評價.Cre僅在該模型動物的特定類型細胞中表達，可精準體內定位靶細胞.當基因組中含有Cre/LoxP位點的rAAV載體物理轉導Cre陽性的細胞后，其相應基因組序列發生反轉重組，通過聚合酶鏈式反應（PCR），就可以檢出靶向轉導特定細胞的rAAV載體.Hillestad等［17］采用CREATE平臺對常用的rAAV1，rAAV8和rAAV9載體的體內轉導行為進行評價，證實rAAV8和rAAV9載體的肝靶向轉導能力優于rAAV1，與基于細胞和動物模型的評價體系結果一致.同時發現，隨著給藥劑量增加，rAAV8和rAAV9載體的脫靶轉導現象越來越明顯，說明CREATE平臺的細胞分辨率顯著提高，更適合細胞水平的篩選和評價.采用CREATE平臺對基于rAAV9改造的候選載體進行評價，發現AAV-PHP.B載體轉導中樞神經細胞的效率比原rAAV9提高了40倍，且主要局限于星狀膠質細胞和神經元［16］.在AAV-PHP.B基礎上繼續進行改造和篩選，又發現了靶向轉導皮層神經元和紋狀體神經元的AAV-PHP.eB載體，以及靶向轉導外周背根神經節神經元的AAV-PHP.S載體［18］，為今后中樞神經系統的精準基因治療提供了優化載體.

2.2 基于功能轉導的評價方法

物理轉導效率高只能說明該載體基因組可以順利完成胞質轉運和入核等過程，不能說明轉基因表達效率的高低.研究表明，蛋白酶體抑制劑可以有效促進rAAV載體的胞質轉運［19］，在蛋白酶體抑制劑的作用下，胞內rAAV2載體DNA的數量增加了4～7倍，但轉基因表達效率卻提高了36～105倍［20］，說明物理轉導與功能轉導的效率差距甚大，物理轉導不能準確反映轉錄與翻譯等關鍵步驟的行為.也有研究發現，有些rAAV載體雖然物理轉導效率類似，但轉基因表達效率卻迥異，甚至出現物理轉導效率高但轉基因表達水平低的現象［21］，提示根據功能轉導的評價體系可更為客觀地表征其轉導行為.

Tabebordbar等［22］設計的利用轉基因 RNA 體內表達的 AAV 衣殼定向進化（DELIVER）策略，采用功能轉導進行rAAV載體的評價（圖2）.在候選rAAV載體基因組中插入條碼序列（BC）以便后期身份辨識，動物用藥后，測定相關組織或細胞中各載體對應的mRNA的水平，就可以了解相應載體的功能轉導效率，與流式分析技術結合，還可以分析載體的細胞靶向轉導特性.利用該策略篩選得到的MyoAAV載體，不僅對骨骼肌和心臟組織具有靶向轉導特性，而且顯著降低了對肝臟的轉導能力.研究還發現，采用從人巨細胞病毒中發現的通用啟動子CMV啟動子時，rAAV載體的物理轉導與功能轉導之間并不存在線性相關性［22］，進一步強調了僅基于物理轉導進行載體評價的缺陷.

對rAAV載體的免疫毒性研究發現，除衣殼蛋白外，其基因組DNA構成也可以誘導宿主細胞天然免疫反應［23］.血友病基因治療臨床研究已經證實，rAAV基因組中的CpG基序與免疫毒性存在相關性［24］.因此，在保證功能轉導效率的前提下，盡量降低物理轉導與轉導效率的比率應當作為rAAV載體的優化條件之一.

2.3 物理和功能轉導相結合的評價體系

近期研究發現，不同組織/細胞中表達的tRNA種類和水平也存在顯著差異，意味著同一DNA模板在不同組織/細胞中存在轉錄效率的差異，基因組DNA與所表達的mRNA之間未必存在相關性［22］.這一發現引起研究人員對rAAV載體評價策略的反思，無論是物理轉導還是功能轉導，都難以單獨作為最佳載體的判斷依據［25］.

在rAAV載體的轉導過程中，物理轉導和功能轉導既相互區分，又前后連貫.基因組DNA對免疫毒性的誘導作用，提醒著不能忽視其物理轉導效率的評價［26］.為了全面評估rAAV載體的轉導效率與毒性風險，Westhaus等［13］提出同時評價物理轉導和功能轉導的新方法（圖2）.Cabanes-Creus等［27］采用該方法，利用人肝嵌合小鼠，從rAAV候選文庫中成功優選出對人肝細胞具有靶向轉導作用的新型載體AAV-SYD，并揭示了其衣殼蛋白序列對物理轉導和功能轉導性能的貢獻.

通過物理轉導與功能轉導的綜合評價，可從細胞水平揭示rAAV載體的胞內命運，有助于篩選轉基因表達效率高且毒副反應風險小的載體.但該方法難以揭示靶細胞在體內的空間分布信息及rAAV轉導過程的細胞異質性現象.

3 單細胞、單分子水平評價rAAV的轉導特性

3.1 單分子水平考察rAAV載體的胞內轉化

因rAAV載體發生染色體整合的概率很低，學界普遍認為，rAAV載體介導的轉基因長期表達依賴于以附加體（episome）形式存在的環狀dsDNA.基因組以dsDNA存在的自身互補型rAAV載體，在細胞內無需第二鏈合成即可表達轉基因，但其要實現長期表達，也需要環狀dsDNA的形成.因此，在單分子水平考察rAAV載體的胞內轉化過程，并揭示制約二鏈合成、DNA環化的載體或細胞因素，是對現有載體進行優化改造的可行思路.基于擴增的單分子熒光原位雜交技術［28］為在單分子水平研究rAAV載體DNA的胞內轉化提供了可能.

3.2 單細胞水平考察rAAV載體的空間轉導特性

體內器官均具有鮮明的細胞空間異質性特征，如肝臟內肝細胞、肝竇內皮細胞（LSEC）等各類細胞的空間分布直接影響其功能［29］.LSEC和肝細胞分別是第八、九因子的天然生產細胞，這兩種因子表達異常會分別引起甲型或乙型血友病.動物實驗發現，在肝細胞中異位表達第八因子雖然可以緩解甲型血友病癥狀，但也會誘導免疫應激［30］.以LSEC為靶細胞開展的基因治療動物研究，既可以實現第八因子的長期表達，又可避免免疫反應的發生［31］.因此，采用空間原位單細胞測序技術［32］，在細胞水平精準評價rAAV載體的體內空間轉導特性，對于提高其細胞靶向轉導、克服其免疫毒性具有重要意義.

4 結論

目前，已批準上市的6種rAAV基因藥物使用的載體均來自天然AAV血清型，具體為AAV1，AAV2，AAV5和AAV9，其選擇依據均基于傳統的藥效學評價.rAAV載體篩選及評價體系，如表1所示.因AAV本質上是病毒而非理想的基因遞送載體，在治療基因的靶向遞送及安全性方面存在天生缺陷，因而需要從其轉導的細胞和分子機制入手進行篩選和評價.通過物理轉導和功能轉導性能的評價，可以準確預測rAAV的靶細胞及轉基因表達效率，將兩種性能綜合評估，還有利于進一步提升所篩選載體的有效性，降低安全性風險（表1）.從單分子單細胞水平對rAAV的胞內命運進行解析，將克服現有技術存在難以揭示其體內轉導細胞及空間異質性難題，為新一代rAAV載體的開發提供評價手段.

臨床前評價是rAAV基因藥物研發的關鍵步驟.既然rAAV被公認為是最安全有效且能夠長期保持轉基因表達的病毒載體［2-3］，進入臨床應用的理想rAAV載體，就應當具備在恰當的細胞以恰當的水平長期表達轉基因的能力，具體應具備的特性如下：1） 時間特性，持續表達轉基因，“一次治療、終身治愈”；2） 空間特性，在恰當的靶細胞內表達轉基因，既可以有效發揮活性，又沒有安全隱患；3） 模式特性，rAAV載體的免疫毒性具有劑量依賴性特征，在保證功能轉導的前提下盡量降低物理轉導，是保持轉基因表達水平適中，又不會誘導細胞應激及免疫反應的最佳模式.綜合應用分子生物學、病毒學、藥學等學科的最新技術，構建精準可靠的臨床前評價體系，將為rAAV基因藥物更有效、更安全、更廣泛的臨床應用奠定堅實的基礎.

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（責任編輯：? 黃曉楠 ?英文審校： 劉源崗）

收稿日期： 2023-05-29

通信作者： 刁勇（1967-），男，教授，博士，博士生導師，主要從事基因藥物的研究.E-mail：diaoyong@hqu.edu.cn.

基金項目： 國家自然科學基金資助項目（81371669， 81271691， 30973591）； 福建省泉州市科技計劃項目（2022C 006R）

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