石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物互作關系研究

宋佳宇，李昀照，李興春，李丹丹，王慶宏，史 權，陳春茂

1. 中國石油大學（北京）化學工程與環境學院，重質油全國重點實驗室，油氣污染防治北京市重點實驗室，北京 102249

2. 中國石油集團安全環保技術研究院有限公司，石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京 102206

全球氣候變化制約著人類社會發展，如何轉化、利用與封存大氣中CO2已成為當今社會關注的焦點.土壤碳儲量超過全球陸地碳儲量的80%(約為2 300 Pg)，是陸地生態系統最大的碳庫，其碳收支的微小變化會顯著影響大氣CO2濃度[1-2]. 增加土壤碳儲量是經濟可行和環境友好的固碳途徑之一，也是減緩全球氣候變化的重要舉措.

傳統的土壤有機質形成理論認為，植物來源的有機碳是土壤有機碳形成與穩定的主要貢獻者[3]. 據統計，每年植被捕獲的CO2約為570×108t[4]，通過植物固碳是實現土壤碳封存的關鍵. 2017年，Liang等[5]提出土壤微生物碳泵(microbial carbon pump，MCP)的概念，該概念強調土壤微生物同化合成作用對土壤碳庫積累有積極作用，微生物殘體碳作為土壤穩定有機碳庫的重要組分，對土壤碳截獲與有機碳固存意義重大[6-7]. 此外，微生物作為土壤碳循環的關鍵驅動因素[8]，利用其固定CO2是一種經濟且無污染的方式，可為提升土壤固碳潛力與減少大氣CO2濃度提供新思路.

固碳微生物根據營養方式不同可分為自養微生物與異養微生物. 自養微生物以CO2為唯一碳源，利用光合作用或化能合成作用將CO2轉化為自身細胞物質來實現光合CO2固定；異養微生物以有機碳化合物為碳源，通過自身代謝過程中的羧化反應實現碳固定[9]. 土壤固碳微生物大多為自養微生物，由于其分布廣泛、數量可觀且環境適應性強而成為目前生物固碳的熱點. 近年來，國內外針對固碳微生物的研究，主要集中在海洋[10]、稻田[11]、農田[12]、濕地[13]等生境的碳儲量分布與評估、微生物固碳過程與固碳機理、微藻固碳與生物能源技術等方面，而針對石油烴等難降解有機物脅迫下的土壤中是否存在降污固碳微生物類群及其互作響應關系的研究尚鮮見報道.因此，開展石油污染土壤降污固碳微生物研究對土壤有機碳固存和減緩全球氣候變化具有重要意義.

綜上，本研究以華北某油田石油污染土壤為對象，開展石油烴降解與固碳微生物響應關系分析，明確潛在降污固碳微生物關鍵屬，闡明石油烴降解與固碳功能基因互作關系；選用高通量測序技術分析石油污染脅迫下土壤微生物降污固碳代謝通路，為探究石油污染土壤微生物降污固碳協同作用機制奠定理論基礎.

1 材料與方法

1.1 土壤樣品基礎信息

研究區域為華北某油田(38°43′00′′N、117°30′00′′E)，該油田勘探始于20世紀60年代，已進入開發中后期. 該區域屬于季風半濕潤氣候區，年均氣溫14.0 ℃，年降水量782.6 mm，土壤pH＞8，屬于弱堿性土壤且多為鹽堿地，土壤類型以草甸土和濱海鹽土為主[14-15].

土壤樣品于2022年7月取自該油田開發井場的表層(0～20 cm)土壤. 設定20 m×20 m的采樣區，利用五點采樣法等量采集各分點土壤，將各分點土壤混合均勻即為該樣點樣品. 用無菌鐵鏟鏟取約500 g土樣后裝入無菌密封袋，共計采集12個土壤樣品，去除動植物殘體及礫石后裝入4 ℃冰盒運回實驗室進一步處理. 將混勻后樣品平均分為兩份，一份自然風干后過2 mm篩并置于4 ℃冰箱保存，用于土壤理化指標及總石油烴測定；另一份置于—80 ℃超低溫冰箱保存，用于土壤微生物多樣性及宏基因組測序. 土壤理化指標、總石油烴測試、微生物多樣性及宏基因組測序前處理試驗均在一周內完成.

1.2 土壤理化指標測試方法

本研究測定物理指標包括微團聚體及土壤含水率2種，化學指標包括pH以及TP(總磷)、TN(總氮)、TOC(總有機碳)、銨態氮、硝態氮含量. 每個樣品取3份作為平行樣品，土壤樣品理化指標測試結果見表1.

表1 土壤樣品理化指標測試結果Table 1 Test results of physical and chemical index analysis of soil samples

1.3 土壤總石油烴測定方法

土壤總石油烴測定方法參照《土壤和沉積物 石油烴(C10-C40)的測定氣相色譜法》(HJ 1021—2019).稱取10.00 g土壤樣品于研缽中，加入適量硅藻土研磨至散粒狀，研磨后樣品利用快速溶劑萃取儀萃取(AES-350型，美國賽默飛世爾科技公司)，萃取條件：壓力1 200 psi，萃取溫度100 ℃，靜態萃取5 min，淋洗體積60%，氮氣吹掃60 s，循環2次，萃取劑為丙酮-正己烷混合溶劑(色譜純，體積比1∶1)，萃取液經100 mL超純水洗滌兩次后保留上層有機相，經無水硫酸鈉(優級純)脫水后旋轉蒸發濃縮至1.00 mL(RV 10型，德國IKA公司)，即得待測樣品.

選用氣相色譜儀〔7890A型，安捷倫科技(中國)有限公司〕測定待測樣品TPH（total petroleum hydrocarbon，總石油烴），檢測器為火焰離子化檢測器，色譜柱采用毛細管色譜柱〔DB-5MS型，安捷倫科技(中國)有限公司；柱長30 mm，內徑0.32 mm，膜厚0.25 μm〕. 儀器條件：進樣口溫度300 ℃，檢測器溫度325 ℃，柱溫320 ℃. 升溫程序：初始50 ℃保持2 min，以40 ℃/min升溫至230 ℃，以20 ℃/min升溫至320 ℃保持20 min；氣體流量分別為99.999%的高純氮氣1.5 mL/min、99.99%的高純氫氣30 mL/min和空氣300 mL/min；不分流進樣，進樣量為1 μL.

土壤樣品按照總石油烴含量由低到高依次編號為S1～S12，總石油烴含量見表2.

表2 土壤樣品總石油烴含量Table 2 Total petroleum hydrocarbon content in soil samples

1.4 土壤樣品微生物分子生物學指標測試方法

1.4.1 土壤樣品DNA提取

根據DNeasy?96 PowerSoil?Pro QIAcube?HT Kit說明書提取土壤微生物群落總DNA，利用超微量分光光度計(NanoDrop2000型，美國賽默飛世爾科技公司)和1%的瓊脂糖凝膠測定DNA濃度和純度.

1.4.2 實時熒光定量PCR

利用qPCR(Real-time Quantitative PCR, qPCR)測定樣品中石油烴降解功能基因alkB、PAH-RHDα GN、PAH-RHDα GP及固碳功能基因cbbL、cbbM、aclB、fhs的豐度，每個樣品設置3個技術重復. qPCR體系包含2×SYBR Green Mix 7.5 μL，正向和反向引物各0.7 μL，模板DNA 1 μL，加無菌ddH2O至15 μL. 反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸35 s，45個循環. 選擇經過測序、序列比對后的陽性克隆子進行擴大培養，提取質粒DNA，紫外檢測儀(NanoDrop ND-1000型，美國賽默飛世爾科技公司)檢測濃度后以10倍梯度稀釋進行標準曲線繪制(共6個梯度，每孔上樣量為2 μL)，梯度拷貝數數量級依次為107、106、105、104、103、102. 擴增得到的熔解曲線均為單峰，說明引物特異性良好，擴增效率為95%～110%，標準曲線R2均大于0.990. 石油烴降解及固碳功能基因引物設計見表3.

表3 石油烴降解及固碳功能基因的引物設計Table 3 Primers design of functional genes for petroleum hydrocarbon degradation and carbon fixation

1.4.3 微生物多樣性及宏基因組測序

微生物多樣性測序采用引物338F(5'-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3')對16S rRNA基因的V3～V4可變區進行PCR擴增. PCR擴增體系(20 μL)：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，引物338F和806R各0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA溶液0.2 μL，模板DNA 10 ng，加無菌ddH2O至20 μL. 擴增反應程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，29個循環，72 ℃最終延伸10 min. 采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(美國Axygen公司)切膠純化回收PCR擴增產物，回收后的擴增產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測. 選擇Miseq PE300平臺(美國Illumina公司)進行微生物多樣性測序.

宏基因組測序利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測土壤DNA，采用非接觸式超聲波破碎儀(M220型，美國Covaris公司)將DNA片段化，篩選約400 bp片段構建宏基因組文庫. 選用NEXTFLEXTM Rapid DNASeq試劑盒(美國Bioo Scientific公司)建庫后進行橋式PCR擴增，即得DNA片段序列. 選擇NovaSeq 6000平臺(美國Illumina公司)進行宏基因組測序.

微生物多樣性及宏基因組測序平臺均由上海美吉生物醫藥科技有限公司提供.

1.5 數據處理及分析

采用R 3.3.1完成物種群落組成制圖；采用Cytoscape 3.7.1繪制物種相關性網絡圖；采用SPSS 26.0軟件進行Spearman相關性分析；采用Origin 2022軟件繪制功能基因相關性與代謝通路圖.

2 結果與討論

2.1 石油污染脅迫下土壤微生物群落結構及多樣性分析

Alpha多樣性指數是用于評價土壤微生物群落多樣性和豐富度的綜合性指標. 其中，Shannon-Wiener指數反映樣品群落多樣性變化情況，該指數越高，樣品群落多樣性越豐富. Sobs、Ace指數反映樣品群落豐富程度，其數值越高，對應樣品物種數越多. 不同石油污染程度土壤樣品Alpha多樣性變化情況見表4. 由表4可知，所有樣品覆蓋度(Coverage)均在0.98以上，表明所得測序結果可以代表土壤樣品微生物群落的實際情況. Sobs及Ace指數隨土壤總石油烴含量的增加均呈先減少后增加再降低的趨勢，表明石油污染脅迫下，土壤微生物群落結構發生了改變，污染程度相對嚴重的土壤樣品微生物豐富度低于污染程度較輕的樣品，此外，總石油烴含量過高可能會對土壤微生物產生毒害作用，導致微生物豐富度降低，該結論與Khan等[24-26]的研究結果一致. Shannon-Wiener指數并未隨總石油烴含量的升高呈現明顯變化規律.

表4 土壤樣品的Alpha多樣性指數Table 4 Alpha diversity index of soil samples

以97%相似性OTU(operational taxonomic units，操作分類單元)代表序列進行土壤微生物分類學分析，抽平后共獲得4 906個OTU，包含58個門，168個綱，383個目，615個科，1 184個屬，2 241個種，將平均相對豐度小于1%的門水平物種歸入其他類別(others)，土壤樣品門水平微生物群落結構變化情況見圖1. 如圖1所示，石油污染土壤中相對豐度較高的門水平優勢物種共6種，分別為變形菌門(Proteobacteria，占比為22.35%～65.7%)、放線菌門(Actinobacteriota，占比為5.24%～39.7%)、綠彎菌門(Chloroflexi，占比為4.61%～15.79%)、厚壁菌門(Firmicutes，占比為3.47%～15.94%)、酸桿菌門(Acidobacteriota，占比為1.25%～15.63%)和擬桿菌門(Bacteroidota，占比為0.80%～3.13%).

圖1 石油污染脅迫下土壤微生物門水平上的物種組成Fig.1 Species composition at the phylum level in oil-contaminated soils

上述優勢菌門均在石油污染土壤中普遍存在，并對脂肪烴、芳香烴和瀝青質等[27-31]典型石油類污染物具有較強的生物降解作用. 此外，亦發現上述菌門可通過卡爾文循環、還原乙酰輔酶A途徑、還原性三羧酸循環等常見的微生物固碳途徑實現光合碳固定[32-34].

綜上，石油污染脅迫下，土壤微生物群落結構發生了改變. 變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、酸桿菌門和擬桿菌門為石油污染土壤優勢菌門.

2.2 石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物相關性網絡分析

為深入探究石油污染脅迫下土壤石油烴降解及固碳微生物潛在互作關系，基于2.1節結論，采用Spearman相關性分析對可能同時具備石油烴降解及固碳功能的6個門水平物種(變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、擬桿菌門)中總豐度前40位的屬水平物種進行篩選，保留相關系數絕對值＞0.8、顯著性p值≤0.05的物種進行后續研究.篩選后物種為變形菌門(占比為42.31%)、放線菌門(占比為34.62%)、酸桿菌門(占比為11.54%)、綠彎菌門(占比為7.69%)和厚壁菌門(占比為3.85%)5個門水平中的26種屬水平物種. 上述26種屬水平物種網絡節點屬性見表5，相關性網絡見圖2.

圖2 石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物相關性網絡(屬水平)Fig.2 Correlation network map of potential pollution-reducing and carbon-fixing microorganisms in oil-contaminated soil (genus level)

表5 石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物網絡節點屬性Table 5 Attribute table of potential pollution-reducing and carbonfixing microbial network nodes in oil-contaminated soil

網絡節點屬性包括連通性、度中心性等，可反映節點在網絡圖中的重要程度. 其中，連通性表示網絡中直接與該節點相連的節點數目，連通性越高表示該節點在整個網絡中越重要；度中心性是最直接度量節點中心性的指標，其數值越大表明該節點在網絡中重要程度越高. 根據表5所示連通性及度中心性結果可知，類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)為關鍵屬.

類諾卡氏菌屬對石油烴類污染物具有較高的降解能力[35]，亦為我國黃土高原地區的優勢固碳微生物[36]，可通過3-羥基丙酸雙循環與還原性三羧酸循環實現大氣CO2的固定[37]；鏈霉菌屬作為石油烴專性降解菌能夠實現石油烴的高效降解[38]，周盛等[39]在我國南方地區農田土壤中發現其具有固定CO2的能力；假單胞菌屬可參與烷烴及芳香烴的好氧與厭氧降解過程[40-43]，在活性污泥、沼液及農田土壤中具有潛在固碳功能[7]，此外，王小利等[44]發現鏈霉菌屬和假單胞菌屬也是農田生態系統碳固定途徑的標志性微生物；鞘脂單胞菌屬是多環芳烴降解微生物的關鍵菌種之一[45]，在我國北方草原與森林地區土壤中具有一定的固碳潛力且為優勢固碳屬[36]. 由此猜測，類諾卡氏菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬及鞘脂單胞菌屬可能為石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳關鍵屬，有待進一步深入論證.

石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物相關性網絡見圖2. 本相關性網絡共包含26個節點和46條連線，其中，正相關連線數為39，負相關連線數為7.基于表6所示結果，本研究后續重點圍繞4種關鍵屬水平物種進行討論. 相關性分析結果表明，假單胞菌屬豐度與鏈霉菌屬(r=—0.818，p=0.001)、類諾卡氏菌屬(r=—0.811，p=0.001)豐度均呈極顯著負相關，鏈霉菌屬豐度與類諾卡氏菌屬(r=0.895，p＜0.001)豐度呈極顯著正相關，鞘脂單胞菌屬豐度與鏈霉菌屬(r=0.895，p＜0.001)、類諾卡氏菌屬(r=0.916，p＜0.001)豐度均呈極顯著正相關. Weiss等[46]認為，物種相關性網絡中存在正相關關系的微生物可能為共生微生物，存在負相關關系的微生物可能為拮抗微生物. 據此，石油污染土壤中假單胞菌屬與鏈霉菌屬、類諾卡氏菌屬可能以競爭關系共存，類諾卡氏菌屬、鞘脂單胞菌屬、鏈霉菌屬可能以互利共生關系共存.

表6 石油烴降解及固碳功能基因豐度Table 6 Abundance of functional genes for petroleum hydrocarbon degradation and carbon fixation

綜上，石油污染土壤中潛在降污固碳微生物多以互利共生方式共存，類諾卡氏菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬及鞘脂單胞菌屬可能為石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳關鍵屬.

2.3 石油烴降解及固碳功能基因的響應關系分析

目前，已知的自養微生物固碳途徑主要有7條：卡爾文循環、還原性三羧酸循環、還原乙酰輔酶A途徑、3-羥基丙酸雙循環、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環、二羧酸/4-羥基丁酸循環以及反向甘氨酸裂解途徑[47-48]. 其中，卡爾文循環是自然界中最重要的微生物光合碳固定途徑，還原乙酰輔酶A途徑相比卡爾文循環更經濟快速，還原性三羧酸循環耗能更低[49-50].土壤微生物不同功能基因通過編碼特定功能蛋白參與微生物的生理生化過程，不同代謝過程的功能基因具有特異性. 卡爾文循環關鍵酶RubisCO酶編碼基因為cbbL和cbbM基因，還原性三羧酸循環關鍵酶ATP-檸檬酸裂解酶編碼基因為aclB基因，還原乙酰輔酶A途徑關鍵酶甲酰四氫葉酸合成酶編碼基因為fhs基因[47-48,51].

為明確石油污染脅迫下土壤微生物石油烴降解與固碳功能基因間的響應關系，本研究對這兩類功能基因進行Spearman相關性分析. 選擇烷烴單加氧酶基因(alkB)[52-53]及芳香烴環羥基化雙加氧酶基因(PAH-RHDα)[54-55]代表典型石油烴降解功能基因，選擇cbbL、cbbM基因、aclB基因和fhs基因代表固碳功能基因，分析結果見圖3，基因豐度測定結果見表6.

如表6所示，固碳基因cbbM、aclB、fhs均呈現較高豐度，表明石油污染土壤微生物具備利用卡爾文循環、還原性三羧酸循環及還原乙酰輔酶A途徑3種方式實現碳固定的潛力. 此外，cbbM基因豐度普遍高于其余固碳功能基因豐度，表明卡爾文循環可能為石油污染脅迫下土壤微生物最主要的固碳途徑.

由圖3可知，烷烴降解功能基因alkB豐度與固碳功能基因cbbL(r=0.846，p=0.001)、aclB(r=0.825，p=0.001)、fhs(r=0.853，p＜0.001)的豐度均呈極顯著正相關；芳烴降解功能基因PAH-RHDα GP豐度與固碳功能基因cbbL豐度(r=0.825，p=0.001)呈極顯著正相關，與fhs(r=0.706，p=0.010)、aclB(r=0.650，p=0.022)豐度均呈顯著正相關. 由此可知，烷烴降解與還原乙酰輔酶A途徑關系更為密切，芳烴降解與卡爾文循環關系更為密切.

基于2.2節結果，石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物的4種關鍵屬隸屬于變形菌門及放線菌門(見圖2)，其中，變形菌門主要通過卡爾文循環、還原乙酰輔酶A途徑、還原性三羧酸循環實現空氣中CO2的固定[32]；放線菌門主要通過卡爾文循環、還原乙酰輔酶A途徑實現光合碳固定[32-34]. 此外，厲舒禎等[56-58]等在上述兩個門水平物種中均發現存在alkB、PAH-RHDα等石油烴降解功能基因.

綜上，石油污染土壤石油烴降解功能基因豐度與固碳功能基因豐度呈正相關，推測石油污染脅迫下土壤微生物降解石油烴與固碳存在協同作用關系.

2.4 石油污染脅迫下土壤潛在降污固碳微生物代謝通路分析

KEGG數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/keeg)[59]由日本京都大學生物信息學中心的Kanehisa實驗室建立，是國內外相關研究者常用的生物體內代謝分析與代謝網絡分析數據庫之一. 本研究選取石油烴降解和固碳功能基因豐度較高的6個土壤樣品(S1、S3、S4、S10、S11、S12，見表4)進行宏基因組測序，利用KEGG數據庫注釋上述樣品功能基因組成及代謝通路.

KEGG數據庫為生物代謝通路分析數據庫，包括細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝和機體系統6類一級代謝通路. 土壤樣品微生物一級代謝通路相對豐度見表7. 由表7可知，新陳代謝通路相對豐度最高，占比均高于76.00%，故后續重點分析該通路，并選取新陳代謝二級代謝通路中能量代謝及外源物質生物降解分別代表微生物固碳途徑[60]和有機污染物去除過程[61-62]. 能量代謝及外源物質生物降解功能注釋見圖4.

圖4 能量代謝和外源物質生物降解功能注釋Fig.4 Functional annotation of energy metabolism and xenobiotics biodegradation

表7 6個土壤樣品中一級代謝通路的相對豐度Table 7 Relative abundance of primary metabolic pathways of six samples

如圖4所示，樣品中均注釋到與石油烴降解及固碳相關的代謝通路，且固碳代謝通路的相對豐度(平均占比為10.60%)顯著高于石油烴降解代謝通路(平均占比為1.78%)，表明上述兩種代謝通路在石油污染土壤中同時存在且微生物碳代謝更為活躍. 從外源物質生物降解通路角度分析，注釋到苯甲酸鹽降解(平均相對豐度為8.12%)、氨基苯甲酸酯降解(平均相對豐度為3.44%)、苯乙烯降解(平均相對豐度為1.87%)等多條與苯環結構物質代謝相關通路，表明石油污染脅迫下土壤微生物具備多環芳烴類有機污染物的降解能力. 從能量代謝通路角度分析，注釋到原核生物碳固定及光合生物碳固定2條與固碳代謝相關通路，其中，原核生物碳固定占比均大于14.00%(S1、S3、S4、S10、S11、S12分別為15.32%、14.37%、14.73%、17.14%、17.02%、15.67%)，光合生物碳固定占比均大于5.00%(S1、S3、S4、S10、S11、S12分別為5.88%、6.21%、5.62%、6.36%、6.31%、6.54%). 據此，推測石油污染脅迫下土壤微生物可能兼具石油烴降解與光合碳固定的能力.

目前，對于石油污染土壤碳循環已有相關研究，如Li等[63]發現石油污染程度顯著影響土壤微生物碳循環基因與其他功能基因間的互作關系；Chen等[60]對頁巖氣開采區表層土壤的微生物固碳途徑研究結果表明該區域潛在的固碳途徑為還原性三羧酸循環.然而，目前國內外針對石油污染土壤微生物降污固碳協同作用機制鮮有報道，故后續亟待圍繞石油污染脅迫下土壤微生物石油烴降解與光合碳固定代謝通路互作機制等開展相關研究.

3 結論

a) 石油污染脅迫下土壤微生物群落豐富度和多樣性隨總石油烴含量的增加呈先減少后增加再減少的趨勢，優勢菌門為變形菌門(占比為22.35%～65.7%)、放線菌門(占比為5.24%～39.7%)、綠彎菌門(占比為4.61%～15.79%)、厚壁菌門(占比為3.47%～15.94%)、酸桿菌門(占比為1.25%～15.63%)和擬桿菌門(占比為0.80%～3.13%).

b) 根據物種相關性網絡分析結果，猜測類諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬、假單胞菌屬及鞘脂單胞菌屬為石油污染脅迫下土壤降污固碳關鍵屬. 其中，假單胞菌屬與鏈霉菌屬、類諾卡氏菌屬以競爭方式共存；類諾卡氏菌屬、鞘脂單胞菌屬、鏈霉菌屬以互利共生方式共存.

c) 根據功能基因相關性分析結果，猜測石油烴降解及固碳功能基因可能存在協同作用，alkB豐度與cbbL(r=0.846，p=0.001)、aclB(r=0.825，p=0.001)、fhs(r=0.853，p＜0.001)的豐度均呈極顯著正相關關系；PAH-RHDαGP豐度與cbbL豐度(r=0.825，p=0.001)呈極顯著正相關關系，與fhs(r=0.706，p=0.010)、aclB(r=0.650，p=0.022)豐度均呈顯著正相關.

d) KEGG數據庫功能注釋結果表明，石油污染脅迫土壤中同時存在石油烴降解和固碳代謝通路，且固碳代謝通路相對豐度顯著高于石油烴降解代謝通路.