納米CaO2促進污泥厭氧發酵產酸性能的微生物機制

潘 禹，劉 鱺，智笑涵，朱洪濤*

1. 北京林業大學，北京市水污染源頭控制技術重點實驗室，北京 100083

2. 北京林業大學環境科學與工程學院，北京 100083

污水處理廠剩余污泥的產量逐年增加，預計2025年將達7×107t (80%含水率)[1]. 剩余污泥不僅對環境和人類健康構成威脅[2]，而且處理處置成本高，在處理過程中會釋放大量溫室氣體[3-4]. 污泥厭氧消化技術可以有效實現剩余污泥的無害化處置和資源/能源回收. 按三階段理論，厭氧消化可分為水解階段、酸化階段和產甲烷階段. 短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)是酸化階段的產物，可以作為生物能源、脫氮除磷碳源或工業產品的前驅體，與甲烷相比其附加值更高、用途更廣泛[5]. 然而污泥厭氧發酵工藝還存在污泥水解效率低和產物SCFAs損耗的問題. 剩余污泥由有機、無機顆粒與微生物聚集體組成，并通過胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)膠結絮凝在一起，其中EPS可占污泥總有機物的50%以上[6]. 厭氧發酵過程中微生物EPS難降解、污泥細胞溶胞困難等問題限制了污泥的水解速率，是污泥厭氧發酵的主要限速原因[7]. 另外，產甲烷過程也會消耗一部分SCFAs[8].

CaO2含有高能過氧化物共價鍵，溶于水會釋放Ca(OH)2和多種活性氧成分 (reactive oxygen species,ROS)如·O2—、·OH、H2O2和O2，是一種氧化能力極強的無機過氧化物[9]. 有研究證實，向污泥厭氧發酵體系中直接投加CaO2可以大幅提高SCFAs產量.如Huang等[10-11]研究顯示，當CaO2投加比例(以污泥揮發性懸浮固體計)為0.10～0.20時，活性污泥厭氧發酵中SCFAs最高濃度可以提升3～4倍；Liang等[12]試驗結果顯示，當CaO2投加比例(以污泥揮發性懸浮固體計)為0.30時，SCFAs含量最高為271.1 mg/g.在機理方面，目前普遍認為CaO2的加入增強了污泥絮體的水解，為酸化階段提供了物質基礎；堿性條件抑制了產甲烷過程，減少了對SCFAs的消耗[13]. 但該機理還存在一些疑問，雖然CaO2會通過分解細胞為產酸階段提供更多基質，但其釋放的ROS會對死活細菌進行無差別的攻擊，即會降低活細胞數量[14]. 在活菌數降低的條件下，SCFAs產量的提升必然需要更有利于SCFAs生產的功能菌群結構，那么這種菌群結構是如何被“雕塑”出來的?有研究發現，CaO2對水解酸化菌群的抑制作用較弱，從而富集了擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)等水解產酸相關菌群，而消耗SCFAs的菌群相對豐度降低[15-16]，但這沒有解釋CaO2為何對不同種類細菌產生了不同的作用.

在CaO2氧化脅迫下，功能菌群的存活可能與細菌胞外保護構造(EPS、細胞壁)和胞內的抗氧化酶系統有關. 研究[17]顯示，細菌的EPS具有較強的抗氧化能力，且細胞內的抗氧化酶系統也會保護機體免受ROS的損傷，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)等[18].該研究將從微生物角度探討CaO2促進污泥厭氧發酵產SCFAs的原因，通過監測發酵過程中抗氧化酶和EPS的變化情況，揭示CaO2如何影響功能菌群并使其向有利于產SCFAs的菌群結構轉化，以期為下一步有針對性地研制更加高效能、低成本的污泥厭氧發酵產酸促進劑提供理論指導.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

剩余污泥取自北京某污水處理廠，接種污泥取自一污泥厭氧發酵反應器. 剩余污泥與接種污泥的性質如表1所示. 試驗使用的納米CaO2顆粒通過Ca(NO3)2和H2O2的反應來進行制備[19].

表1 稀釋污泥和接種污泥的性質Table 1 Characteristics of the diluted feed sludge and inoculum sludge

1.2 試驗設計

CaO2對污泥厭氧發酵產SCFAs的影響試驗：首先向14個有效容積為500 mL的錐形瓶中分別加入450 mL稀釋污泥和50 mL接種污泥；然后向錐形瓶中加入CaO2，CaO2投加比例(以污泥VS計)分別為0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35，依次標記為C-0、C-10、C-15、C-20、C-25、C-30、C-35. 每個梯度設置2個平行；接著向各錐形瓶中通入氮氣曝氣5 min后密封，以去除溶解氧；最后將錐形瓶置于35 °C、160 r/min的恒溫振蕩器中厭氧發酵13 d，每天從瓶中取10 mL污泥樣品，10 000 r/min下離心10 min后，再使用0.45 μm有機系膜過濾上清液用于后續常規指標測定.

1.3 檢測方法

NH4+-N、SCOD(溶解性化學需氧量)濃度分別使用納氏試劑法和重鉻酸鉀消解法測定[20]；可溶性蛋白質和多糖的濃度分別通過福林酚試劑法和硫酸蒽酮法測定[21-22]；SCFAs濃度使用氣相色譜儀(GC-2010，日本島津公司)測定；微生物EPS的提取參考Domínguez等[23]的方法.

抗氧化酶活性測定前先制備粗酶液，取7 mL活性污泥，10 000 r/min下離心2 min棄其上清液，用PBS溶液洗滌2次. 在4 ℃水浴條件下用細胞破碎儀超聲破碎10 min(工作3 s，停5 s)，破碎后的樣品在4 ℃下以20 000 r/min離心6 min，用0.45 μm水系膜過濾上清液得到粗酶液. SOD、CAT活性以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量均使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒(目錄號分別為A001-1、A084-1-1、A003-1-2)測定.

1.4 高通量測序及分析

采用16S rRNA高通量測序方法表征微生物群落結構. 在第6天采集C-0、C-15、C-25、C-35組的污泥樣本并進行高通量測序. 首先使用 E.Z.N.A.? soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)試劑盒進行微生物群落總DNA抽提；然后選用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')對16S rRNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增，PCR產物采用Quantus? Fluorometer(Promega, USA)進行檢測定量；接著通過NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫，并利用美國Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序；最后使用UPARSE軟件對97%的相似度對有效序列進行OTU聚類.

2 結果與討論

2.1 CaO2對水解與產酸階段的影響

圖1為污泥厭氧發酵過程中各參數的逐日變化情況. 未投加CaO2前，各組因組成相同其pH均為7.45. CaO2的投加顯著提高了各處理組的pH，其中C-35組的pH最高達到9.90，這與CaO2水解生成Ca(OH)2有關. 在第一天各處理組pH達到最大值，后持續下降并穩定在6.60～7.00之間〔見圖1(a)〕.

圖1 不同CaO2投加比例對水解和酸化指標的影響Fig.1 Effects of different CaO2 dosages on hydrolysis and acidification

對照組(C-0組)的SCOD濃度顯著低于各處理組〔見圖1(b)〕，各處理組中SCOD濃度水平隨CaO2投加比例的加大而提高，其中C-35組在第9天達到最大值(2 088 mg/L)，約為C-0組的4.6倍. CaO2所釋放的具有強氧化性的ROS會破壞污泥絮體結構，促進污泥的溶胞. 同時CaO2釋放出的O2會刺激需氧微生物產生胞外酶，進一步提高厭氧條件下難降解化合物的水解效率[24-25].

在厭氧發酵過程中，各組NH4+-N濃度持續上升，處理組仍高于對照組〔見圖1(c)〕. NH4+-N主要來自蛋白質和氨基酸的水解. C-30組和C-35組所釋放的ROS較多，導致初期大量微生物死亡，為后期優勢菌種水解蛋白質產生NH4+-N提供了原料. 蛋白質和多糖濃度與CaO2投加比例均呈顯著正相關〔見圖1(d)(e)〕.

SCFAs濃度隨CaO2投加比例增加而升高〔見圖1(f)〕，但各處理組到達峰值的時間不同，其中對照組和低投加比例組(C-10組、C-15組)產酸較快，在第2天即達到SCFAs濃度峰值，而C-35組則在第11天達到最大值(1 424 mg/L). SCFAs濃度增加與CaO2的氧化作用以及釋放的堿度有關，二者均加速了污泥破解，為產酸階段提供了更多的基質. 低投加比例組因對功能微生物抑制較小，所以產酸速度快，但由于污泥水解的效果較差，導致最終SCFAs產量低，高投加比例組則恰恰相反.

2.2 CaO2對微生物群落的影響

表2為不同CaO2投加比例下微生物群落的豐富度和多樣性指數. C-0組中Ace指數和Chao指數均小于C-15組而大于C-35組，說明低投加比例的CaO2提高了物種的豐富度，高投加比例的CaO2降低了微生物的豐富度. Shannon-Wiener指數和Simpson指數可反映微生物群落物種數與物種均勻程度，前者隨CaO2投加比例增加而減小，后者則隨CaO2投加比例增加而增大. 這表明CaO2降低了物種的多樣性與均勻程度，使微生物群落向特定的優勢菌種組合轉化.

表2 不同CaO2投加比例下微生物群落的豐富度與多樣性Table 2 The richness and diversity of bacterial communities under different CaO2 dosages

從圖2(a)微生物群落韋恩圖的OTU數量變化可知，較低投加比例的CaO2提升了物種的多樣性，隨著CaO2劑量的增加OTU數量顯著下降，與表2結果一致. 主坐標分析(PCoA)的結果顯示〔見圖2(b)〕，4組樣本之間的微生物群落結構存在明顯差異，且CaO2投加比例越高，微生物群落結構差異越大.

圖2 不同CaO2投加比例下微生物群落的變化Fig.2 Microbial community changes under different CaO2 dosages

圖3(a)為不同樣本在門水平上微生物群落的變化. 如圖3(a)所示，4組樣本的微生物群落結構具有顯著差異性. C-0組中綠彎菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)為主要的優勢菌門，而厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度較低，僅占7.16%. 隨著CaO2投加比例的增加，Firmicutes相對豐度顯著上升. 在C-35組中Firmicutes相對豐度增至64.23%，成為占主導地位的優勢菌門，其他細菌相對豐度則明顯下降. Firmicutes是堿性發酵系統中普遍存在的細菌群落，其細胞壁較厚，能產生孢子，生存能力強，在降解有機物和厭氧發酵生產SCFAs方面發揮著重要作用[26]. 微生物群落中相對豐度下降的菌門均為與產酸無關的門類，如Chloroflexi與SCFAs生產呈負相關[27]，Acidobacteriota則與氮磷去除有關[28].

圖3 不同CaO2投加比例下微生物群落結構的變化Fig.3 Composition of microbial communities under different CaO2 dosages

綱水平〔見圖3(b)〕上，C-0組中梭菌綱(Clostridia)和芽孢桿菌綱(Bacilli)的相對豐度占比分別為5.87%和0.88%，在C-35組中則分別增至26.59%和36.59%.Clostridia和Bacilli均屬于Firmicutes，生存能力強.Clostridia可將復雜的不溶性底物水解成較小的可溶性分子，如醋酸鹽和丁酸鹽[29]. 另外，Bacilli和Clostridia也可以共同促進SCFAs的生產，Bacilli更易于利用多糖[29]. C-35組的多糖濃度高于其他組(見圖1)，因此高劑量的CaO2促進多糖釋放的同時也促進了Bacilli富集. 在堿性條件下，Bacilli是產SCFAs的主要功能菌種之一[25].

在屬水平上，芽孢桿菌屬(Bacillus)、瘤胃解蛋白質菌屬 (Proteiniclasticum)和金黃微桿菌屬(Chryseomicrobium)為C-35組的優勢菌屬，占比分別為27.42%、12.11%和6.66%，三者皆屬于Firmicutes.其中，Bacillus對SCFAs的生產起重要作用[30]；Proteiniclasticum則為水解細菌，可分泌水解酶將蛋白質和多糖轉化為氨基酸和單糖[31].

2.3 CaO2對細菌群落EPS的影響

圖4為第2天和第4天微生物不同EPS中蛋白質和多糖占比的變化. 在同一時段，多糖和蛋白質尤其是多糖，在TB-EPS中的占比隨CaO2投加比例的增加而顯著下降，在S-EPS和LB-EPS中的占比則隨CaO2投加比例的增加稍有升高. 可見CaO2使緊密結合的TB-EPS部分轉化為S-EPS和LB-EPS，體現了ROS存在時EPS對細菌細胞的保護，且多糖是微生物EPS中起保護作用更強的組分.

圖4 不同CaO2投加比例下EPS中蛋白質和多糖占比的變化Fig.4 Changes in the proportion of proteins and polysaccharides in different EPS under different CaO2 dosages

基于16S rRNA測序，利用 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)預測微生物不同代謝通路的相對豐度. 圖5為4組樣本中ABC轉運蛋白代謝通路的相對豐度. ABC轉運蛋白途徑與細菌分泌胞外多糖有關. 隨著CaO2投加比例增加，ABC轉運蛋白代謝通路的相對豐度逐漸增加，表明細菌通過該通路分泌多糖的代謝過程增強. 這從代謝通路基因的角度解釋了S-EPS和LB-EPS中多糖占比隨著CaO2投加比例增加而上升的現象〔見圖4(a)〕.

圖5 不同CaO2投加比例下ABC轉運蛋白代謝通路的相對豐度Fig.5 Relative abundances of ABC transporters under different CaO2 dosages

2.4 CaO2對細菌群落MDA和抗氧化酶的影響

2.4.1 MDA相對含量的變化情況

ROS攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化形成MDA，故MDA可作為標志物反映細胞氧化損傷的程度[32]. 從第2天和第5天的MDA相對含量(見圖6)來看，C-35組的MDA相對含量顯著高于其他兩組，表明細胞受到的氧化損傷隨著CaO2劑量增加而增大. 細菌受到氧化損傷導致胞內的內容物流出，從而提高了發酵體系中SCOD的濃度. 第5天的MDA相對含量與第2天相比均有一定的下降，這是由于CaO2對污泥的破解作用逐漸減弱. 低CaO2投加比例組中SCFAs的生成速率較快〔見圖1(f)〕，可能與細菌的氧化損傷較小有關，抗氧化酶可以及時分解活性氧，減少氧化應激，使更多功能細菌存活.

圖6 不同CaO2投加比例下MDA相對含量的變化情況Fig.6 Changes of MDA content under different CaO2 concentrations

2.4.2 SOD活性和相關基因的變化情況

SOD存在于細菌和古細菌中，可將·O2—轉化為H2O2[33]. 圖7(a)為SOD活性的變化情況. 在發酵的第1天，C-0組SOD活性高于處理組，且C-15組要高于C-25組與C-35組. 這可能是因為高CaO2投加比例所造成的氧化脅迫會破壞細胞氧化還原平衡，造成細胞損傷甚至死亡[34]. 隨著反應進行，可分泌SOD以抵抗CaO2氧化脅迫的細菌逐漸富集，在第7天，SOD活性得到了大幅提升.

圖7 不同CaO2投加比例下SOD活性和基因相對豐度變化Fig.7 Changes of SOD activity and related gene abundance under different CaO2 concentrations

圖7(b)為第6天不同組SOD相關同源基因相對豐度的變化情況. K04564和K04565分別代表Fe-SOD/Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的同源基因，前者存在于原核細胞中，后者存在于真核細胞中. C-35組的總SOD相關基因相對豐度高于其他三組，與之對應，第7天該組SOD活性最高，表明CaO2可通過淘汰不具有或者很少具有SOD基因的細菌而使得SOD基因相對豐度提高，從而有利于SOD基因的表達和分泌. 因此在CaO2氧化脅迫下，存活的優勢菌群可能與其可以大量分泌SOD的抗氧化能力相關.

2.4.3 CAT活性和相關基因的變化情況

CAT可以將H2O2轉化為O2和H2O[35]. 圖8(a)是第1天和第7天的CAT活性變化情況. 在第1天C-15組CAT活性高于C-0組，表明CaO2刺激了細菌群落的CAT分泌. 但高CaO2投加比例組較低，這同樣是由于高投加比例的CaO2造成細菌在初期大量死亡.第7天處理組CAT活性均高于C-0組，且C-35組活性顯著增加. 通過圖8(b)的CAT同源基因相對豐度的變化可以發現，隨著CaO2投加比例的升高，菌群的CAT基因相對豐度隨之提升，這解釋了發酵第7天CAT活性增加的原因. CAT的增加減輕了細菌受到的氧化損傷，促進了優勢菌群的繁殖，進而促進了SCFAs的生產.

3 結論

a) CaO2會顯著促進污泥的水解，并使發酵過程呈堿性. 當CaO2投加比例為0.35時，污泥厭氧發酵效果最好，SCOD濃度最高為2 088 mg/L，約為對照組(C-0組)的4.6倍；SCFAs濃度最高為1 424 mg/L，約為對照組(C-0組)的4.3倍.

b) CaO2會降低微生物群落的多樣性，Firmicutes門相對豐度從對照組的7.16%增至C-35組的64.23%，但會抑制其他細菌. SCFAs產量較高，這與Clostridia和Bacilli綱相對豐度顯著增加相關. 另外，不同比例的CaO2對細菌群落的影響程度不同.

c) 功能細菌通過提高EPS尤其是胞外多糖的合成與分泌來對抗CaO2氧化脅迫，但TB-EPS會轉化為LB-EPS和S-EPS. 投加CaO2提高了EPS中多糖的占比，增強了對細胞結構的保護，利于功能菌群的存活.

d) CaO2提高了功能菌群SOD和CAT相關基因的相對豐度，預期可促進SOD和CAT的分泌，增強細菌的抗氧化能力，使微生物群落中的水解酸化菌群(如Bacillus和Chryseomicrobium)逐漸富集.